磺胺类兽药胶体金免疫层析法的研究

论文摘要

本论文研究胶体金免疫层析法检测食品中五种磺胺类药物残留。利用磺胺类药物的特异性多克隆抗体和半抗原偶联物（SAs-OVA）对五种磺胺类兽药残留检测的免疫层析方法进行了系统的研究。论文优化并建立了磺胺多残留胶体金免疫层析分析方法,并有效运用于猪肉、鸡肉、鲫鱼三种样品中磺胺类药物的筛选。采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm的胶体金,对其进行紫外图谱质量鉴定,标记在多克隆抗体上,将胶体金标记磺胺类多克隆抗体复合物喷涂在玻璃纤维垫上,并将人工合成的包被抗原（SAs-OVA）、羊抗兔二抗固定在硝酸纤维素薄膜上作为检测线和质控线,经过组装制成胶体金免疫层析试纸条。优化条件为：SAs-OVA包被浓度为0.65mg/mL,金标抗体的稀释倍数为1：10,羊抗兔二抗以1：100比例稀释,包被原与羊抗兔二抗的划膜参数设定为1μL/cm。五种磺胺类多残留试纸条的检出限：磺胺异噁中（SIZ）、磺胺噻哗（STZ）、磺胺对甲氧基嘧啶（SME）、磺胺二甲嘧啶（SMT）、磺胺氯哒嗪（SCPA）在标准品溶液中的视觉检出限均为1μg/L,消色检出限为10μg/L对猪肉、鸡肉、鲫鱼三种样品进行添加回收实验,经过甲醇与PBST缓冲液分步骤进行提取,用PBS溶液稀释10倍后即可消除基质影响。上述五种磺胺药物在这三种样品基质中的最低视觉检出限均为0.01mg/kg;消色检出限为0.1mg/kg,均小于或等于国家最低残留限量（0.1mg/kg）。试纸条分别被密封并保存在4℃、室温、37℃进行稳定性实验,最终在室温密封干燥条件下放置3个月后仍可保持检测结果的稳定性和可靠性。该方法的检测时间小于10min。而且具有比较高的灵敏度和特异性,操作快速、简便,并保证结果稳定可靠,可作为磺胺类药物多残留的现场监控筛检手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 兽药残留概述
• 1.1.1 兽药残留现状
• 1.1.2 兽药残留的危害
• 1.1.3 控制动物源性食品中兽药残留的措施
• 1.2 磺胺类药物概述
• 1.2.1 磺胺类药物简介
• 1.2.2 抗菌活性及作用机理
• 1.2.3 磺胺类药物的毒性作用
• 1.2.4 动物源性食品中磺胺类药物的残留
• 1.2.5 磺胺类药物的常用分析方法
• 1.3 免疫胶体金层析技术及应用
• 1.3.1 胶体金的性质和特点
• 1.3.2 胶体金的制备
• 1.3.3 金标抗体的制备、纯化与保存
• 1.3.4 胶体金免疫层析技术
• 1.4 论文研究的目的及意义
• 1.5 论文研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 待测样品
• 2.1.4 溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗磺胺簇特异性多克隆抗体的预处理
• 2.2.2 磺胺类包被抗原的合成
• 2.2.3 胶体金的制备
• 2.2.4 胶体金标记抗体蛋白
• 2.2.5 免疫层析试纸条硝酸纤维素膜的选择
• 2.2.6 包被原稀释液的优化
• 2.2.7 层析条件的选择
• 2.2.8 样品垫的处理
• 2.2.9 胶体金试纸条的组装
• 2.2.10 免疫层析试纸条检测方法和结果判断
• 2.2.11 磺胺类药物多残留免疫层析试纸条检测限的确定
• 2.2.12 磺胺多残留试纸条方法特异性的检测
• 2.2.13 样品检测
• 2.2.14 试纸条稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 磺胺多克隆抗体的预处理
• 3.1.1 磺胺多克隆抗体的纯化
• 3.1.2 磺胺多克隆抗体浓度的测定
• 3.2 包被原合成的质量鉴定
• 3.3 胶体金溶液的制备与质量鉴定
• 3.3.1 胶体金的制备
• 3.3.2 胶体金的质量鉴定
• 3.4 胶体金标记抗体蛋白
• 3.4.1 胶体金标记抗体时最适pH的测定
• 3.4.2 胶体金标记抗体的最适蛋白量测定
• 3.5 金标抗体的质量鉴定
• 3.6 免疫层析试纸条硝酸纤维素膜的选择
• 3.7 包被原稀释液的优化
• 3.7.1 包被原稀释液浓度的选择
• 3.7.2 包被原稀释液中甲醇加入量的选择
• 3.8 层析条件的选择
• 3.8.1 包被原和金标抗体稀释倍数的选择
• 3.8.2 羊抗兔二抗及包被原划膜参数的选择
• 3.8.3 包被原包被条件的选择
• 3.8.4 金标抗体干燥条件的选择
• 3.9 样品垫的处理
• 3.9.1 样品垫处理液中表面活性剂的选择
• 3.9.2 样品垫处理液配方的优化
• 3.10 免疫层析试纸条检测限的确定
• 3.11 磺胺类药物多残留试纸条方法特异性的确定
• 3.12 实际样品检测
• 3.12.1 样品中待测物的提取
• 3.12.2 样品基质影响的消除
• 3.12.3 磺胺类药物多残留试纸条基质影响消除结果
• 3.12.4 磺胺类药物多残留试纸条待测物添加回收实验
• 3.13 磺胺类药物多残留试纸条试纸条稳定性实验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢