论文摘要
金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的病原菌,随着抗生素的广泛使用,细菌的耐药性问题也趋于严重,近年来相继出现青霉素耐药菌株、甲氧西林耐药菌株和万古霉素耐药菌株。细菌的耐药性从医院内发展至医院外,同时也从对单一耐药发展至多重耐药,成为临床治疗棘手的难题。因此,探求新的不同于抗生素的抗菌药物对于改善感染性疾病的治疗现状具有重要意义。近年来许多研究表明柑橘属植物的有效提取物具有抑菌的生物活性,由于其毒副作用小,无环境污染,在抗感染方面具有良好的应用前景。因此,本文旨在检测柑橘属植物的柠檬提取物对临床多重耐药金黄色葡萄球菌的抑菌效果并对其抑菌机制进行初步探索,为新型抗菌药物的开发奠定工作基础。首先采用美国Microsdan autoscan-4全自动耐药检测系统证实和分析临床分离金黄色葡萄球菌菌株的多重耐药谱。结果表明,TH-3、TH-4和TH-18耐药菌谱的表达呈现一致性,即对青霉素类、大环内酯类、喹诺酮类等8类抗生素耐药,而TH-14对大环内酯类抗尘素敏感,仅对7类抗生素耐药。采用纸片法观察柠檬提取物对耐药金黄色葡萄球菌的抑菌效果,结果4株耐药金黄色葡萄球菌的抑菌环直径均≥30mm（分别为33mm,32mm,30mm和33mm）,说明柠檬提取物具有较强的抑菌活性。试管法测定柠檬提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.16μl/ml,所以确定1/2 MIC亚抑菌浓度用于金黄色葡萄球菌细胞壁形态变异的观察和抑菌机制的探讨。高分子滤膜法制备金黄色葡萄球菌生物膜后,加入柠檬提取物（每张膜片加5ml）,分别作用60、120和180分钟,通过细菌菌落计数判定不同生物膜的细菌存活数,结果柠檬提取物对生物膜中的细菌具有杀菌作用,且随作用时间的延长而逐渐增强(分别为1.6×107cfu·mL-1、2.5×106cfu·mL-1和5.6×104cfu·mL-1)。继而,对柠檬提取物抑制多重耐药金黄色葡萄球菌的机制进行初步探讨。将柠檬提取物（终浓度为1/2 MIC）作用于临床分离金黄色葡萄球菌多重耐药菌株,同时设立相应对照组。分别采用SDS-PAGE电泳法,观察柠檬提取物对菌体蛋白质的影响;EcoR I酶切金黄色葡萄球菌DNA,观察酶切图谱的改变;聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR-Restriction Fragment LengthPolymorphism,PCR-RFLP）检测柠檬提取物作用下细菌氟喹诺酮耐药基因（84位密码子）gyrA位点的突变情况。结果表明,柠檬提取物对细菌蛋白质的组成和表达量均有一定影响,同时细菌DNA的EcoR I酶切图谱发生改变,但并不影响细菌氟喹诺酮耐药基因（84位密码子）gyrA位点的改变。此外,用BECKMAN半自动生化分析仪测定细菌胞内乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）的活性,并在低渗环境下动态观察柠檬提取物在不同作用时间（5、10和15分钟）对细菌细胞壁的影响。结果15分钟时细菌呈现明显的胞壁缺损现象,即细菌个体胀大,呈现大球形。但LDH、ALT和AST的活性并无明显变化（P＞0.05）。综上,本文采用的柠檬提取物对多重耐药金黄色葡萄球菌及其形成的生物膜具有明显的抑制作用,提示其在感染性疾病以及生物膜相关性疾病的治疗中将具有广阔的应用前景。