内皮抑素融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定

论文摘要

1997年O’Reilly等从鼠的血管内皮细胞瘤（EOMA）培养液中分离得到一种新的血管生成抑制因子,命名为内皮抑素（Endostatin）。内皮抑素能有效抑制血管内皮细胞的增殖,进而抑制新生血管生成。由于肿瘤的发生和发展必须依赖大量的血管生成,因此,内皮抑素为肿瘤治疗提供了新的途径。目前已上市的抗癌新药恩度（Endostar）半衰期较短（约为10h）,需要每天静脉注射给药,加重了患者的经济负担。因此开发长效的内皮抑素药物显得更加重要。本研究旨在构建Endostatin与人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）的融合基因EndoAlbu,表达EndoAlbu融合蛋白,可望延长内皮抑素的半衰期,为开发长效的内皮抑素制剂奠定基础。1. EndoAlbu融合蛋白的空间结构预测为了延长Endostatin在体内作用的半衰期,采用富含甘氨酸与丝氨酸的柔性肽（Gly4Ser）3将Endostatin与HSA进行连接,构成EndoAlbu融合蛋白。HSA由三个相似的结构域组成,每个结构域由两个亚结构域组成,形成圆桶状结构,几乎所有疏水性氨基酸都包埋在圆桶内部,构成疏水腔。为了验证HSA这种特殊的蛋白结构在融合蛋白中是否对Endostatin的功能位点产生影响,我们对融合蛋白的结构进行了预测。结果表明Endostatin的结构域保持独立。2. EndoAlbu融合基因的构建采用重叠延伸PCR的方法,构建了融合基因EndoAlbu,并将其克隆入pGEM-T载体中。测序结果表明融合基因序列与GenBank数据库（NCBI）中的Endostatin的AJ494837及HSA的CR607928序列完全一致。3. EndoAlbu融合蛋白的表达、鉴定与纯化将EndoAlbu融合基因克隆至酵母表达载体pPIC9中,然后将鉴定正确的重组表达载体pPIC9-EndoAlbu线性化后转入GS115。采用原位双膜筛选法快速筛选出表达株,并对其进一步鉴定后进行扩大培养。采用硫酸铵沉淀和蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析的方法从酵母培养液的上清中成功分离出高纯度的目的蛋白。4. EndoAlbu融合蛋白的生物学活性测定采用MTT法对纯化后的EndoAlbu融合蛋白进行测定,结果表明EndoAlbu融合蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV-304的增殖具有很好的抑制作用,抑制作用呈现剂量依赖性,其IC50为8.4μg/mL。在CAM实验中发现其能显著抑制CAMx新生血管生长。5.结论本研究在对EndoAlbu融合蛋白空间结构预测的基础上,构建了EndoAlbu融合基因,并对融合蛋白进行了表达、鉴定、纯化及生物学活性的测定。结果表明表达的EndoAlbu融合蛋白具有良好的生物学活性,为长效Endostatin制剂的研究提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 综述基因修饰药物的长效性
• 1 国内外生物制药行业状况
• 2基因工程药物销售情况与市场前景
• 3 基因工程药物的优、缺点
• 4长效蛋白质和多肽药物
• 4.1 PEG 化修饰
• 4.2 基因融合
• 4.2.1 HSA 融合蛋白
• 4.2.2 Fc 融合蛋白
• 4.3 构建突变体
• 4.4 点突变
• 4.5 制剂改造
• 5 结语
• 参考文献
• 第一章 EndoAlbu 融合蛋白的空间结构预测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 寻找内皮抑素与白蛋白的模板蛋白
• 2.2 将目的蛋白与模板蛋白的氨基酸序列进行比较
• 2.3 EndoAlbu 复合物的三维结构
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 EndoAlbu 融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒和引物
• 1.2 工具酶和试剂盒
• 1.3 试剂
• 1.4 溶液和培养基
• 1.5 仪器
• 1.6 重组酵母分泌表达载体pPIC9/EndoAlbu 的构建技术路线
• 1.7 人内皮抑素基因（Endostatin）片段的克隆
• 1.7.1 引物的设计与合成
• 1.7.2 Endostatin 片段的PCR 扩增
• 1.7.3 目的基因片段的回收
• 1.8 人白蛋白基因（Albumin）片段的克隆
• 1.8.1 引物的设计与合成
• 1.8.2 Albumin片段的PCR扩增及纯化
• 1.9 融合蛋白基因EndoAlbu的PCR扩增及纯化
• 1.10 重组质粒pGEM-T/EndoAlbu的构建
• 1.10.1 融合基因EndoAlbu 的PCR 回收产物加A 尾
• 1.10.2 将目的基因克隆入pGEM-T载体
• 1.10.3 大肠杆菌TOP10感受态的制备及转化
• 1.10.4 重组子的鉴定
• 1.10.5 重组子的测序
• 1.11 重组质粒pPIC9/EndoAlbu的构建
• 1.11.1 目的基因EndoAlbu的回收
• 1.11.2 质粒pPIC9- hpc相应片段的回收
• 1.11.3 将EndoAlbu 基因克隆入pPIC9 载体
• 1.11.4 将重组质粒pPIC9/EndoAlbu转化入TOP10
• 1.11.5 重组子的鉴定
• 1.12 重组质粒导入酵母
• 1.12.1 质粒（pPIC9-EndoAlbu）的大量制备
• 1.12.2 重组表达质粒（pPIC9-EndoAlbu）的线性化
• 1.12.3 转化毕赤酵母
• 1.13 转化株表型的筛选
• 1.14 阳性转化子的筛选
• 1.14.1 菌落PCR 筛选法
• 1.14.2 原位双膜法快速检测阳性高表达株
• 1.15 外源基因在酵母中的表达与检测
• 1.15.1 细胞的培养和诱导表达
• 1.15.2 表达蛋白位置的鉴定
• 1.15.3 表达产物的抗原性鉴定（Western blot）
• 1.16 诱导时间对表达量的影响
• 1.17 测定EndoAlbu 融合蛋白的表达量
• 1.17.1 酵母上清总蛋白表达量的测定
• 1.17.2 EndoAlbu 融合蛋白占总分泌蛋白百分比的测定
• 1.17.3 EndoAlbu 融合蛋白的表达量的测定
• 1.18 外源基因的规模化表达
• 1.19 表达产物的纯化
• 1.19.1 菌体的发酵
• 1.19.2 发酵液的纯化
• 2 结果
• 2.1 重组质粒pGEM-T/EndoAlbu 的构建
• 2.1.1 PCR 扩增Endostatin 片段
• 2.1.2 PCR 扩增Albumin 片段
• 2.1.3 重叠 PCR 扩增EndoAlbu 片段
• 2.1.4 重组质粒pGEM-T/EndoAlbu 的鉴定
• 2.2 重组质粒pGEM-T/EndoAlbu 的序列测定
• 2.3 重组质粒pPIC9/EndoAlbu的构建与鉴定
• 2.4 重组质粒pPIC9/EndoAlbu的酶切鉴定
• 2.5 转化酵母重组蛋白的表达
• 2.5.1 酵母重组子的PCR检测
• 2.5.2 原位双膜法的快速筛选
• 2.6 表达产物EndoAlbu 融合蛋白的Western blot 鉴定
• 2.7 诱导时间对表达量的影响
• 2.8 酵母上清中EndoAlbu 融合蛋白表达量的测定
• 2.9 表达产物EndoAlbu 融合蛋白的纯化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 EndoAlbu 融合蛋白的生物学活性
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞株和SPF 种蛋
• 1.2 试剂
• 1.3 溶液
• 1.4 试剂盒
• 1.5 仪器
• 1.6 人脐静脉内皮细胞系ECV-304 细胞的培养
• 1.6.1 冻存细胞的复苏
• 1.6.2 细胞传代
• 1.7 MTT 法检测EndoAlbu 融合蛋白的体外生物学活性
• 1.7.1 试液的配制
• 1.7.2 MTT 操作步骤
• 1.8 鸡胚绒毛尿囊膜法（CAM 法）检测 EndoAlbu 融合蛋白的体内生物学性鉴定
• 1.8.1 试液的配制
• 1.8.2 鸡胚绒毛尿囊膜技术操作步骤
• 2 结果
• 2.1 MTT 法检测EndoAlbu 融合蛋白的体外生物学活性
• 2.1.1 EndoAlbu 融合蛋白作用细胞后的形态学观察
• 2.1.2 通过MTT 法检测EndoAlbu 融合蛋白对细胞增殖的影响
• 2.1.3 半抑制浓度（IC50）的计算
• 2.2 CAM 法检测EndoAlbu 融合蛋白的体内生物学活性
• 2.2.1 血管的生长状况
• 2.2.2 蛋胚的存活率
• 2.2.3 EndoAlbu 融合蛋白对CAM 血管生成的抑制效果
• 3 讨论
• 参考文献
• 总结与展望
• 附录：EndoAlbu 的测序报告
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢