猪细小病毒SC1株非结构蛋白NS1基因的原核表达及PPA-NS1-ELISA方法的初步建立

论文摘要

本研究对已经构建好的重组质粒pPNS1通过EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切后,亚克隆进原核表达载体PET30a（+）中,构建了一株重组表达质粒PET-NS1;对PET-NS1进行酶切、菌落PCR、光生物素标记分子杂交以及测序分析鉴定,表明该重组表达质粒构建确实可靠:将其转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG的诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明重组NS1蛋白得以高效表达,以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的26.7%。并确定了NS1蛋白的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.6mM,诱导时间为3h。Western-Blot鉴定NS1蛋白分子量约86.0KD,具有抗原性。 大量表达的重组蛋白经纯化后作为抗原,包被酶标板,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验（PPA-NS1-ELISA）检测方法。经检测抗原最佳包被浓度为33ug/ml,血清最佳稀释度为1:40,阳性标准初步确定为:OD490待检血清>0.30。与猪乙型脑炎病毒、猪瘟、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性血清呈阴性反应,与猪细小病毒阳性血清呈阳性反应,与本实验室研究的猪伪狂犬病毒重组猪细小病毒二价疫苗免疫猪血清呈阴性反应,与猪细小病毒灭活疫苗免疫猪血清呈阴性反应。检测结果隔周重复检测3次,重复性良好。实验结果表明该方法具有经济、特异性强、灵敏度高的特点,能较好的区分PPV自然感染猪和灭活疫苗免疫猪。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一 材料与方法
• 1 实验材料和主要仪器
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒与菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.1.1 PET-30a（+）载体、pPNS1质粒EcoRI、HindⅢ双酶切、回收
• 2.1.2 大肠杆菌JM109感受态细胞制备
• 2.1.3 重组质粒的连接、转化
• 2.2 重组质粒的鉴定
• 2.2.1 菌落PCR鉴定
• 2.2.2 分子杂交鉴定
• 2.2.3 酶切鉴定
• 2.2.4 测序鉴定
• 2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定
• 2.3.1 重组质粒转化到BL21中
• 2.3.2 表达质粒的提取与鉴定
• 2.3.3 诱导表达
• 2.3.4 Western-blot杂交分析
• 2.4 表达产物的纯化
• 2.4.1 NS1蛋白的获取及纯化
• 2.4.2 NS1蛋白含量的测定
• 2.5 PPA-NS1-ELISA方法的初步建立
• 2.5.1 NS1抗原最佳稀释度和血清最佳稀释度的选择
• 2.5.2 判定标准的确定
• 2.5.3 待检血清中抗E.coli成份的除去
• 2.5.4 PPA-NS1-ELISA方法的操作程序
• 2.5.5 PPA-NS1-ELISA与间接血凝抑制（HI）方法的比较试验
• 2.5.6 NS1-ELISA特异性试验
• 2.5.7 NS1-ELISA重复性试验
• 2.5.8 临床样品的检测
• 二 结果与分析
• 1 重组质粒的鉴定
• 1.1 菌落PCR鉴定
• 1.2 分子杂交鉴定
• 1.3 酶切鉴定
• 1.4 测序鉴定
• 2 重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定
• 2.1 重组质粒转化到大肠杆菌BL21后的酶切鉴定
• 2.2 表达产物的SDS-PAGE电泳
• 2.2.1 最佳诱导条件的确定
• 2.2.2 目的蛋白表达细胞定位的分析
• 2.2.3 目的蛋白表达量的分析
• 2.3 Western-blot杂交分析
• 3 表达产物的纯化
• 3.1 NS1蛋白的纯化
• 3.2 NS1蛋白浓度测定
• 4 PPA-NS1-ELISA方法的初步建立
• 4.1 NS1抗原最佳稀释度和血清最佳稀释度的确定
• 4.2 判定标准的确定
• 4.3 PPA-NS1-ELISA与HI的比较试验
• 4.4 PPA-NS1-ELISA特异性试验
• 4.5 PPA-NS1-ELISA重复性试验
• 4.6 PPA-NS1-ELISA临床样品的检测
• 三 讨论
• 1 关于重组质粒的构建
• 1.1 制备载体
• 1.2 外源片段准备
• 1.3 重组质粒的鉴定
• 2 关于PET载体系统
• 3 关于NS1蛋白诱导表达
• 3.1 诱导表达条件
• 3.2 目的蛋白细胞定位
• 3.3 蛋白质的纯化
• 4 关于PPA-NS1-ELISA方法
• 四 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章目录