论文摘要
人胸腺素α1（Tα1）是由是人体中枢免疫器官胸腺组织上皮细胞所分泌的一种免疫活性极强的多肽激素,起着加强免疫系统功能的作用,可以治疗自身免疫疾病如慢性乙肝、丙肝、红斑狼疮等,还可作为治疗癌症的辅助药物,在临床上具有良好的疗效。Tα1是由28个氨基酸组成的酸性多肽,等电点4.2,相对分子量3108。提取法和化学合成法是目前临床所用的Tα1制剂的主要来源。组织提取法,受到材料来源的限制,产品中Tα1含量低,通常都是胸腺素多肽混合液,影响治疗效果;而化学合成方法,成本高,价格昂贵,限制了Tα1的临床应用。因此探索一条工业化生产Tα1的新工艺,不仅能满足临床的需要,而且为大量制备其他活性多肽具有指导意义。为了克服提取法与合成法的局限,我们试图通过基因工程串联表达法大量制备Tα1。本研究按照大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因片段,经退火及酶切、连接反应获取了Tα1六串体基因Tα1×6,定向克隆至pET-22b（+）表达载体的NdeⅠ和HindⅢ位点之间,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经测序鉴定正确的阳性克隆菌株在IPTG诱导下,融合蛋白Tα1×6得到了高效表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。经离心、洗涤包涵体及DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析,获得了高纯度重组蛋白。经过在试管水平的培养和诱导表达条件摸索后,我们成功地实现了该工程菌的高密度发酵,利用20 L发酵罐经行中试,表达量达到0.9g/L。纯化后的重组蛋白经羟氨处理,在Asn-Gly的Gly处发生裂解释放出单体Tα1多肽。裂解产物用G-25凝胶柱层析分离,可以分别获得未完全裂解多肽和Tα1单体多肽。质谱测定结果显示,裂解单体Tα1多肽与人工合成Tα1多肽分子量相差15,N-末端由天然的乙酰化变为Gly。通过MTT实验表明该裂解单体Tα1具有与化学合成品相当的生物学活性,可以刺激小鼠淋巴细胞分裂增殖。获得具有生物活性的重组Tα1,我们又对其体外活性进行研究。通过流式细胞术检测发现,Tα1作用于脾淋巴细胞时,能使细胞内ROS水平升高、GSH水平降低,激活PKC,刺激细胞增殖。MTT法检测发现,Tα1能使人肝癌HepG-2和肺腺癌SPC-A-1细胞线粒体活性下降,细胞计数实验发现HepG-2经Tα1作用后细胞增殖受到抑制,而低浓度H2O2刺激HepG-2细胞增殖。通过流式细胞术检测,Tα1能降低HepG-2细胞内ROS水平、升高GSH水平,而H2O2作用正好相反。进一步研究发现,Tα1通过降低细胞内ROS水平,下调Akt信号通路来抑制HepG-2细胞的增殖;H2O2则通过升高细胞内ROS水平,激活Akt使细胞增殖加快。PI染色检测发现,Tα1降低HepG-2细胞内ROS水平导致细胞周期在G1期积累,细胞增殖减慢;Tα1升高脾淋巴细胞内ROS水平升高使细胞周期由G1期向S期转变加快,细胞增殖加快。证明细胞周期的正常运行需要细胞内ROS维持在一个正常的水平,Tα1可以通过调节细胞内ROS水平影响细胞周期。本研究成功构建了一个Tα1六串体表达载体pET-22b（+）-Tα1×6,并在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,经20 L发酵罐中试具有良好的工业化应用前景。重组蛋白经羟氨特异性裂解获得具有生物活性的Tα1单体蛋白,为大量生产Tα1满足临床需求开辟了新途径。研究中发现Tα1能影响脾淋巴细胞和肿瘤细胞内的ROS水平,进而分别对两种细胞内的PKC和Akt信号通路产生影响;同时ROS水平的变化也对细胞周期产生影响,最终都导致细胞增殖的改变。这些结果为进一步研究Tα1的活性提供了思路,也为Tα1临床应用于肿瘤治疗提供了理论依据。
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Abstract摘要目录第一篇 文献综述第一章 胸腺素α1的研究进展1.1 Tα1的结构与性质1.2 体内分布1.3 生物活性1.4 临床应用1.5 制备生产第二章 ROS的研究进展2.1 ROS的产生与清除2.2 ROS与细胞信号通路2.2.1 ROS在蛋白质磷酸化中的作用2+信号的调节'>2.2.2 ROS对Ca2+信号的调节2.2.3 ROS与磷脂酶2.2.4 ROS对转录因子活化的刺激作用2.3 ROS与细胞周期2.3.1 细胞周期的调控机制2.3.2 ROS对细胞周期的影响2.4 肿瘤细胞的ROS与Akt2.4.1 ROS与肿瘤细胞2.4.2 Akt信号通路2.4.3 ROS与Akt信号通路参考文献第二篇 实验部分研究目的及意义研究内容技术路线第三章 胸腺素α1（Tα1）基因合成、串联及重组3.1 引言3.2 实验部分3.2.1 试剂与材料3.2.2 主要仪器设备3.2.3 Tα1基因片段的合成3.2.4 合成片断的克隆3.2.5 Tα1基因的串联3.2.6 表达载体构建3.3 实验结果3.3.1 pET-22b（+）质粒PCR鉴定3.3.2 基因测序3.3.3 结果分析3.4 小结参考文献第四章 Tα1六串体蛋白表达、分离纯化4.1 引言4.2 实验部分4.2.1 试剂与材料4.2.2 主要仪器设备4.2.3 Tα1六串体蛋白的表达4.2.4 Tα1六串体蛋白的表达条件优化4.2.5 Tα1六串体蛋白的亚细胞定位4.2.6 重组蛋白的抽提4.2.7 包涵体蛋白的DEAE-阴离子交换层析纯化4.3 实验结果4.3.1 Tα1六串体蛋白的表达4.3.2 Tα1六串体蛋白表达条件优化4.3.3 重组蛋白的亚细胞定位4.3.4 Tα1六串体蛋白的抽提4.3.5 DEAE-阴离子交换树脂纯化包涵体蛋白4.3.6 结果分析4.4 小结参考文献第五章 Tα1六串体蛋白的羟氨裂解5.1 引言5.2 实验部分5.2.1 试剂与材料5.2.2 主要仪器设备5.2.3 Tα1六串体蛋白裂解条件优化5.2.4 重组Tα1单体蛋白的尿素-SDS-PAGE电泳鉴定5.2.5 Tαl六串体蛋白裂解产物的分离纯化5.2.6 Tα1单体蛋白分子量的Mass Spectrum分析5.3 实验结果5.3.1 G-25凝胶层析分离Tα1单体5.3.2 Tα1单体蛋白电泳5.3.3 Tα1六串体蛋白裂解条件优化5.3.4 Tα1单体多肽质谱5.3.5 结果分析5.4 小结参考文献第六章 重组Tα1单体活性鉴定6.1 引言6.2 实验部分6.2.1 试剂与材料6.2.2 主要仪器设备6.2.3 小鼠脾淋巴细胞的分离与培养6.2.4 重组Tα1单体蛋白对小鼠脾淋巴细胞线粒体活性的作用6.2.5 肿瘤细胞的培养6.2.6 重组Tα1单体蛋白对肿瘤细胞线粒体活性的作用6.3 实验结果6.3.1 重组Tα1增强淋巴细胞线粒体活性6.3.2 重组Tα1减弱肿瘤细胞线粒体活性6.3.3 结果分析6.4 小结参考文献第七章 Tα1六串体蛋白工程菌的高密度发酵7.1 引言7.2 实验部分7.2.1 试剂与材料7.2.2 主要仪器设备7.2.3 种子培养7.2.4 高密度发酵7.2.5 补料培养发酵7.3 实验结果7.3.1 高密度发酵7.3.2 补料培养发酵7.3.3 发酵后处理7.3.4 结果分析7.4 小结参考文献第八章 Tα1作用机理的初步研究8.1 引言8.2 实验部分8.2.1 试剂与材料8.2.2 主要仪器设备8.2.3 Tα1对细胞ROS/GSH的影响8.2.4 Tα1对细胞周期的影响8.2.5 Tα1与淋巴细胞凋亡8.2.6 脾淋巴细胞内cAMP和PKC的检测8.2.7 Tα1与HepG-2细胞内Akt信号通路8.3 实验结果8.3.1 Tα1降低HepG-2细胞内ROS水平8.3.2 Tα1升高小鼠脾淋巴细胞内ROS水平1期细胞积累'>8.3.3 Tα1导致HepG-2细胞的G1期细胞积累8.3.4 Tα1导致T-淋巴细胞的S期细胞增加8.3.5 Tα1与淋巴细胞凋亡8.3.6 Tα1对脾细胞cAMP和PKC的影响8.3.7 Tα1与HepG-2细胞Akt信号通路8.3.8 结果分析8.4 小结参考文献结论与展望结论主要创新点后续研究展望英文缩写词表在读博士期间主要工作致谢
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