马来酸水合酶的分离纯化及其性质研究

论文摘要

利用生物催化合成精细化工上大量需要的手性化合物已经成为生物技术应用中的一个非常重要的领域。D-苹果酸是一种重要的手性化工材料,主要是应用于手性药物合成、手性添加剂、手性助剂等领域,具有广阔的开发前景。马来酸水合酶能够催化水合马来酸的加水而生成D—苹果酸。微生物转化马来酸制备D—苹果酸的是一条极具竞争力的制备方法,而催化酶马来酸水合酶的相关研究只停留在纯化和简单性质探讨阶段,进一步进行相关酶类的纯化、理化性质及酶动力学等研究,可为新型羟基合成酶系的开发提供理论指导。 本论文对Arthrobacter pascens DMDC12中所产的马来酸水合酶进行了分离纯化,详细研究了酶的性质。 DMDC12发酵后的菌体经破壁后得到粗酶液,粗酶再经离子交换层析、硫酸铵沉淀以及疏水层析等几步纯化后,得到了三种不同的马来酸水合酶:MHaseA, MHaseB和MHaseC。总酶活回收约41%,纯化倍数近十倍。这是在国际上首次从同一生物体内分离到了三种马来酸水合酶 酶学性质研究表明: 1.三种组分各自的最适催化温度和pH值都不一样,MHaseA的最适催化温度最高,MHaseA和MHaseB的最佳催化pH值偏碱性,而MHaseC则明显偏酸性。 2.Arthrobacter Passcens DMDC12是一株耐盐菌,表现在马来酸水合酶上,三个组分都有很高的耐盐性,高浓度的NaCl对酶活影响不大,而硫酸铵反而提高了酶活。 三个组分的酶活性中心可能不存在还原性的巯基,DTT的存在反而抑制了MHaseA和MHaseB。 低温下,三个组分不容易失活,添加一定的保护剂如硫酸铵、海藻糖、D,L—苹果酸等有利于酶的稳定。三个组分的稳定性有较大的差异,其中MHaseC组分显现出较好的稳定性。 3.三个组分的动力学常数也有较大的差异,MHaseA、MHaseB、MHaseC对马来酸催化的Km值分别为1.874 mM、1.334mM和2.459mM。MHaseA、

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 D—苹果酸的研究进展
• 1.1.1 D—苹果酸的理化性质
• 1.1.2 D—苹果酸的应用
• 1.1.2.1 作为手性前体合成药物
• 1.1.2.2 在手性拆分试剂中的应用
• 1.1.2.3 D—苹果酸作为配体在不对称合成中的应用
• 1.2 D—苹果酸的制备方法
• 1.2.1 化学物理方法合成D—苹果酸
• 1.2.2 生物方法生产D—苹果酸
• 1.2.2.1 微生物拆分法
• 1.2.2.2 酶法生产D—苹果酸
• 1.3 马来酸水合酶的研究进展
• 1.3.1 动物和植物来源的马来酸水合酶
• 1.3.2 微生物来源的马来酸水合酶
• 1.3.3 不同来源的马来酸水合酶的比较
• 1.4 同工酶的背景
• 1.4.1 常用的同工酶的分离和测定方法
• 1.4.2 常用的同工酶的鉴定方法
• 1.5 本课题研究的意义和内容
• 1.5.1 研究意义
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 马来酸水合酶的分离纯化
• 2.1 酶的纯化方法
• 2.1.1 粗酶的制备
• 2.1.1.1 石英砂研磨法
• 2.1.1.2 超声波破碎法
• 2.1.1.3 酶解法
• 2.1.1.4 细胞破碎器
• 2.1.2 硫酸铵沉淀
• 2.1.3 离子交换层析
• 2.1.4 疏水层析
• 2.1.5 PEG透析浓缩
• 2.1.6 SDS—PAGE电泳
• 2.2 实验试剂
• 2.3 实验仪器
• 2.4 马来酸水合酶的分离纯化
• 2.4.1 产酶菌株的发酵
• 2.4.2 酶活测定
• 2.4.3 蛋白量的测定
• 2.4.4 电泳纯度分析
• 2.4.5 纯化流程图
• 2.4.6 纯化结果与讨论
• 2.4.6.1 细胞破碎
• 2.4.6.2 DEAE SepharoseTM Fast Flow离子交换柱层析
• 2.4.6.3 硫酸铵沉淀
• 2.4.6.4 疏水层析
• 2.4.6.5 疏水洗脱活性组分PEG透析浓缩
• 2.4.6.6 发酵时间对马来酸水合酶同工酶比例影响
• 2.4.6.7 纯化结果讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 马来酸水合酶的酶学性质研究
• 3.1 实验仪器
• 3.2 实验试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 温度对酶活的影响
• 3.3.2 pH值对酶活的影响
• 3.3.3 马来酸水合酶耐盐性实验
• 3.3.4 DTT对酶活的影响
• 3.3.5 金属离子对酶活的影响
• 3.3.6 酶的稳定性以及保存条件的实验
• 3.3.7 马来酸水合酶的底物专一性
• m及最大反应速度V_m的测定'>3.3.8 基本动力学常数K_m及最大反应速度V_m的测定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 酶的最适合反应温度
• 3.4.2 酶的最适合反应pH值
• 3.4.3 马来酸水合酶的耐盐性
• 3.4.4 DTT对酶活的影响
• 3.4.5 金属离子对酶活的影响
• 3.4.6 酶的稳定性以及保存条件的实验
• 3.4.7 马来酸水合酶的底物专一性
• m及最大反应速度V_m的测定'>3.4.8 基本动力学常数K_m及最大反应速度V_m的测定
• 3.5 本章小结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢