体外扩增脐血巨核细胞的生物学特性及其体内功能的研究

论文摘要

目的：造血干细胞移植目前已经成为治疗多种恶性疾病的有效方法之一，脐血因具有移植物抗宿主病发生率低的优点，成为造血干细胞的主要来源。但是，有两大因素阻碍了脐血造血干细胞的广泛应用。一是脐血中所含的造血干／祖细胞数目少，不能满足移植的需要，尤其是对一些难治性的血液系统疾病，如范可尼贫血、慢性髓系白血病和重型再生障碍性贫血。二是脐血移植同骨髓和外周血移植相比其植入速度慢，尤其是血小板的恢复时间延长，持续的血小板减少不仅会增加患者出血死亡的可能性，而且反复的血小板输注易导致血小板无效输注及病毒感染机会增加等一系列问题，成为困扰临床的一大难题。脐血中含有大量的干／祖细胞，具有扩增、分化的潜能，因此取出部分的脐血进行巨核系祖细胞的体外扩增及适当的诱导成熟，然后与未扩增部分一并输注回受者体内，从而加速体内血小板的恢复是有望解决这一难题的重要途径。近年来大量的研究证实，多种细胞因子如Flt-3配体（FL）、血小板生成素（TPO）、干细胞因子（SCF）、白介素-3（IL-3）等能支持脐血巨核系祖细胞的定向扩增，且效果明显优于骨髓及外周血造血干细胞。但是，扩增后的巨核祖细胞是否具有体内功能，能否向成熟的巨核细胞分化尚未证实，而且关于短期的扩增效果尚未涉及。目前已有少数研究确认体外扩增后的巨核祖细胞可以植入非糖尿病／免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠动物模型，但关于移植后的巨核祖细胞在体内分化及成熟的研究尚未见到。本文以脐血CD34+造血干细胞为研究对象，应用含有TPO、SCF、IL-3、IL-6不同因子组合的无血清培养体系诱导其向巨核系分化和扩增，并对其植入NOD／SCID小鼠模型后的植入水平进行检测。方法：1．脐血CD34+细胞的分离及体外扩增脐血取自健康足月妊娠的胎盘组织，枸橼酸钠抗凝的血袋保存，4-6小时内进行CD34+细胞分离纯化。Percol密度梯度离心法收集单个核细胞（MNC），采用免疫磁珠法，按CD34细胞分选试剂盒说明纯化细胞。将CD34+细胞接种于含Stem SpanTM SFEM无血清培养基的24孔板中，加入四种不同细胞因子。根据细胞因子不同组合分为3组（1）TPO+SCF+IL-3+IL-6组；（2）TPO+SCF+IL-3组；（3）TPO+SCF组。2．体外扩增后脐血巨核细胞生物学特性的研究（1）巨核细胞表面标志的表达收集第3、7、10、14天的细胞，荧光显微镜检测细胞表面标志CD42b、CD41a、CD61和粘附因子标志CD49d、CD49e、CD11a、CD54的表达。（2）巨核细胞凋亡的检测扩增后的细胞用Annexin V/FITC和碘化丙锭（PI）溶液处理后，流式细胞仪进行检测。（3）巨核细胞形成单位（CFU-Mk）检测将细胞接种于含人甲基纤维素培养基的24孔板中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，进行CFU-GM集落计数，培养前后进行对比。（4）多倍体巨核细胞的检测扩增后的细胞用含有核糖核酸酶（RNase）的碘化丙啶（PI）缓冲液进行处理后，使DNA染色，在流式细胞仪上对CD41+细胞进行多倍体检测。（5）巨核细胞特异性基因的表达按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis试剂盒说明合成cDNA。用荧光定量PCR鉴定基因β-actin、APAF-1、GATA-1、NF-E2、HPRT、GPIIb、TXS的表达。3．体内功能检测（1）体外扩增的巨核细胞移植入NOD／SCID小鼠16只6-8周的NOD／SICD小鼠无菌条件下饲养，分为4组，经亚致死量放射线（350 cGy）全身照，4-6h内将细胞尾静脉注入照射后的小鼠体内。（1）实验组Ⅰ：TPO+SCF+IL-3+IL-6扩增7-10天的细胞。（1）实验组Ⅱ：TPO+SCF扩增7-10天的细胞。（3）阳性对照组：同等数量的CD34+细胞。（4）阴性对照组：同等体积的生理盐水。（2）小鼠骨髓的检测小鼠处死后无菌条件下取小鼠的股骨与胫骨骨髓细胞，荧光显微镜检测人巨核细胞表面标志CD34、CD41、CD45的表达。（3）小鼠外周血中人血小板的检测小鼠处死后心脏取血，荧光显微镜检测鼠源性和人源性抗体CD41的表达。结果：1．分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增，三个实验组的原始巨核细胞（CD34+／CD41+）均在第7天达最高值，且添加IL-3和IL-6的细胞因子组合优于未添加组；三个实验组CD4+、CD42b+、CD61+细胞的扩增倍数随培养时间的延长表达量逐渐增高，三组之间有显著性差异。粘附因子CD49d+、CD11a+、CD49e+的表达均在培养第7天达到最高水平，而CD54+的表达量呈下降趋势。2．SCF、TPO组合在扩增第7天并不能显著抑制细胞凋亡，加入IL-3和IL-6后，Annexin V阳性细胞由（8．26±2．49）％降至（3．51±1．24）％。CFU-MK的数量在第10天时最高，且8倍体及8倍体以上的巨核细胞所占的的百分比增加，即成熟产板型巨核细胞增加。荧光定量PCR测定GATA-1、NF-E2、GPIIb的相对表达量在实验Ⅰ组第7天水平最高，GATA-1、GPIIb的相对表达量在实验Ⅱ组第7天达到最高水平而NF-E2在第10天降到最低之后逐渐回升，凋亡转录因子APAF-1的相对表达逐渐增多，实验Ⅲ组GATA-1、NF-E2、GPIIb的相对表达量在第10天达到水平之后下降，TXS、HPRT的测定基本通NF-E2。3．移植入NOD／SCID小鼠体内后，1周后小鼠骨髓均有人脐血细胞植入，CD45的表达量在两实验组小鼠的骨髓中为（5．47±1．76）％、（6．63±0．57）％，CD41+细胞为（1．70±0．17）％、（2．21±0．31）％。小鼠外周血中人血小板在移植后3天就可测到，两实验组分别再第7天和14天达到高水平（为20．46％和24．37％）。结论：1．三种因子组合TPO+SCF+IL-3+IL-6、TPO+SCF+IL-3和TPO+SCF在体外均可使脐血巨核细胞有效扩增，通过对扩增后巨核细胞的生物学特性的鉴定，认为因子组合TPO+SCF+IL-3+IL-6在第7-10天的扩增效率最高。2．将扩增后的脐血巨核细胞植入NOD／SCID小鼠体内，无论因子组合TPO+SCF+IL-3+IL-6或TPO+SCF均可满足移植的需要，并能在小鼠体内产生血小板，因子组合TPO+SCF搭配简单。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• +细胞向巨核细胞的体外扩增及生物学特性的研究'>第一部分 脐血CD34⁺细胞向巨核细胞的体外扩增及生物学特性的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图表Ⅰ
• 第二部分 体外扩增脐血巨核细胞在NOD/SCID小鼠体内功能的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图表Ⅱ
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表