Hedgehog信号转导通路在胆管癌中作用机制初步研究

论文摘要

胆管癌占消化道肿瘤3%,其年发病率为2-4/100000,并且近年来发病率逐渐上升,是恶性程度最高的致死性肿瘤之一。由于侵袭性强,缺乏有效的早期诊断方法,确诊时往往已经发生转移,诊断后中位生存期不到6个月,预后很差。尽管胆管癌的发病形势日益严峻,死亡率一直居高不下,但目前关于胆管癌发病的分子机制还未完全阐明,这大大限制了胆管癌治疗的发展。因此,加强胆管癌基础研究,提高临床诊疗水平,改善患者预后,仍是迫切需要解决的问题。Hedgehog信号转导通路（Hh信号通路）由HH配体（SHH、IHH、DHH）、2个跨膜蛋白质受体PTCH （PTCH1、PTCH2）和SMO,以及下游的转录因子GLI蛋白（GLI1,GLI2,GLI3）等组成。最近研究发现Hh信号通路的异常激活与多种人类恶性肿瘤的发生发展密切相关,其中包括胆管癌。Berman等报道：在来源于食管、胃、胆道、胰腺和结肠肿瘤的38个细胞系中有37个检测到Hh的mRNA表达,而且Hh信号通路对维持肿瘤细胞的生长和增殖起重要作用。近期Artit Jinawath等研究发现胆管癌七种细胞系（HuCCT1, HuH-28, MEC, TFK-1, RBE, TGBC24TKB andKKU-M156）均表达PTCH1, GLI1也表达于大多数细胞系（除HuCCT-1 andTFK-1外）,提示Hedgehog信号通路在胆管癌细胞中呈激活状态,可能参与胆管癌的发生与发展。Hh信号通路的异常激活与胆管癌之间的密切关系提示,它可能成为临床上开发胆管癌治疗措施的又一新方向。目前已有不少研究者应用该通路特异性的抑制因子如SMO拮抗剂cyclopamine（环耙明）等抑制该通路的活化以进行肿瘤治疗的研究。胆管癌细胞QBC939由wang等建立于1993年,该细胞株生长速度快、细胞群体活力高、独立生存能力强,并且对胰岛素、EGF刺激呈明显增殖反应,而对地塞米松刺激呈生长抑制反应。细胞遗传学检查显示该系呈现明显的染色体数目和结构异常,频繁发生断裂、移位、缺失和插入等多倍体癌细胞比例甚高。该细胞株自建立以来即受到重视并被广为应用,特别是近年来被广泛应用于肿瘤学研究的各个领域。在我们的前期研究中,对比胆管癌细胞QBC939与正常胆管上皮细胞发现Hh信号通路在正常胆管细胞中不表达,但其高表达于胆管癌细胞QBC939（内部资料）。这说明,与其它消化器官肿瘤一样,Hh信号通路仅在胆管癌肿瘤组织中呈现明显的高活性状态,而在正常上皮组织中呈低水平表达。因而,胆管癌细胞QBC939是一种很好的研究Hh信号通路在胆管癌表达变化的细胞株。本文通过研究胚胎发育信号通路Hh在胆管癌中的表达及意义,并且利用cyclopamine在体内和体外特异性阻断人胆管癌细胞系QBC939中的Hh信号传递,观察其对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响,及对裸鼠移植瘤生长的作用,旨在为胆管癌的临床治疗提供依据。本研究包括二部分内容,分述如下。第一部分Hedgehog信号通路中PTCH1和GLI1蛋白在胆管癌组织中的表达及其意义。目的探讨Hedgehog信号通路中PTCH1和GLI1蛋白在胆管癌组织中的表达及其意义。方法采用免疫组化方法检测47例胆管癌组织及癌旁组织中PTCH1、GLI1蛋白的表达情况,并应用配对资料的Spearman等级相关分析其阳性率与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤部位、淋巴结转移状况和TNM分期相关性。结果PTCH1和GLI1蛋白在胆管癌组织中的阳性率分别为70.2%和89.4%,与癌旁组织14.9%和19.1%相比,差异有统计学意义（P<0.05）。PTCH1和GLI1蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤部位等均无关（P>0.05）,而与分化程度、淋巴结转移状况和TNM分期有关（P<0.05）。结论Hedgehog信号通路蛋白PTCH1、GLI1在胆管癌组织中呈高表达状态,它们参与了胆管癌的发生及发展。第二部分在体内及体外特异性阻断HH信号通路对胆管癌细胞系QBC939生长的影响及作用机制目的研究Hedgehog信号通路特异性阻断剂cyclopamine对人胆管癌细胞系QBC939生长、增殖与凋亡的影响方法用MTT法检测cyclopamine对QBC939细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR法分别检测cyclopamine处理前后PTCH1、GLI1、EGFR在QBC939中的mRNA表达及变化,Western blot检测cyclopamine处理前后PTCH1、GLI1、EGFR在QBC939中的蛋白表达及变化；用裸鼠移植瘤模型检测cyclopamine对裸鼠移植瘤生长的抑制作用,免疫组化法检测PTCH1、GLI1、EGFR在裸鼠移植瘤中的表达及变化,TUNE1法检测裸鼠移植瘤在处理前后凋亡变化。结果cyclopamine抑制QBC939细胞的增殖,其作用呈剂量和时间依赖性；经5、10、20μmol·L-1的cyclopamine作用48 h后QBC939细胞的凋亡率逐渐升高,明显高于对照组的凋亡率（P<0.01）;PTCH1、GLI1、EGFR的mRNA和蛋白均在QBC939中表达,并且cyclopamine下调QBC939的PTCH1,GLI1,EGFR的mRNA和蛋白表达；在裸鼠移植瘤模型中,cyclopamine明显抑制移植瘤的生长,并使得PTCH1,GLI1,EGFR表达下降,凋亡率升高而对照组生长无明显抑制作用。结论阻断Hedgehog信号通路能抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,促进其凋亡并明显抑制裸鼠移植瘤的生长。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 Hh信号通路蛋白PTCH1,GLI1在胆管癌组织中的表达及意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 在体内及体外特异性阻断HH信号通路对胆管癌细胞系QBC939生长的 影响及作用机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 英汉缩略词对照表
• 综述
• 参考文献
• 致谢