条件性RNAi敲低技术降低FGFR2的表达对小鼠软骨发育的影响

论文摘要

基因敲除技术是研究基因功能的一种重要手段。基因敲除技术是80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是用DNA同源重组原理，用设计的基因片段代替靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐在被应用，如诱导性基因敲除技术、条件性基因敲除技术、利用随机插入片段进行基因敲除技术、反义核酸技术。近年来，一些新技术也用于研究基因功能，RNA干扰就是其中的一种。RNAi技术是使基因表达降低，通过比较前后基因型的变化，能很方便的鉴定出基因的功能。本实验是用条件性RNAi基因敲低技术来研究小鼠软骨细胞中FGFR2对小鼠软骨发育的作用。首先，鉴定出条件性RNAi敲低FGFR2小鼠FGFR2-RNAi和在软骨细胞特异表达Cre重组蛋白的转基因小鼠Coll2a-Cre，然后让FGFR2-RNAi小鼠和在软骨细胞特异表达Cre重组蛋白的转基因小鼠Coll2a-Cre交配，经过对后代小鼠的基因型鉴定，我们得到双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre，我们观察了雌性双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre和同窝雌性对照体重和时间的关系以及雄性双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre和同窝雄性对照体重和时间的关系，经过统计学分析，发现双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre要比同窝对照小鼠的体重要轻；并进一步分别观察了雌、雄性双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre与同窝对照小鼠的生长板宽度，并进行了统计学分析，发现双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre要比同窝对照小鼠生长板的宽度要小；经过软骨细胞的体外培养，并进行FGFR2的RT-PCR分析，我们发现双转基因小鼠FGFR2RNAi；Coll2a-Cre软骨细胞中FGFR2mRNA相对同窝对照表达降低。上述结果提示可用条件性RNAi敲低技术降低FGFR2在软骨中的表达来观察软骨的发育情况。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 FGF和FGFR2简介
• 1.2 Cre-LoxP重组酶系统简介
• 1.3 FGFR2RNAi小鼠简介
• 1.3.1 RNAi干涉简介
• 1.3.2 FGFR2RNAi小鼠简介
• 1.4 Coll2a-Cre小鼠简介
• 1.5 利用动物模型研究基因功能的优势
• 1.6 研究的目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 小鼠基因型鉴定需要配置的溶液
• 2.1.3 进行切片观察需要配置的一些溶液
• 2.1.4 软骨细胞培养需要的溶液及配置
• 2.1.5 细胞RNA提取需要配置的溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 FGFR2RNAi小鼠基因型的鉴定
• 2.2.1.1 FGFR2RNAi小鼠尾巴DNA的提取
• 2.2.1.2 FGFR2RNAi小鼠PCR鉴定
• 2.2.2 Coll2a-Cre小鼠基因型鉴定
• 2.2.2.1 Coll2a-Cre小鼠尾巴DNA的提取
• 2.2.2.2 引物的确定
• 2.2.2.3 PCR鉴定
• 2.2.2.4 将PCR产物进行电泳鉴定
• 2.2.3 双转基因小鼠基因型的鉴定
• 2.2.3.1 双转基因FGFR2RNA;Coll2a-Cre小鼠DNA的提
• 2.2.3.2 鉴定双转基因小鼠所需引物的确定
• 2.2.3.3 PCR
• 2.2.3.4 PCR产物纯化、测序
• 2.2.4 双转基因小鼠和同窝对照小鼠整体形态观察
• 2.2.4.1 出生后11天小鼠形
• 2.2.4.2 出生后21天小鼠形态观察
• 2.2.4.3 双转基因小鼠与同窝对照小鼠体重与时间的关
• 2.2.4.4 统计学分析
• 2.2.5 双转基因小鼠和同窝对照小鼠生长板切片观察
• 2.2.5.1 出生后11天生长板切片的观察
• 2.2.5.2 出生后21天生长板切片的观察
• 2.2.5.3 统计学分析
• 2.2.6 软骨细胞培养及RT-PCR分析
• 2.2.6.1 软骨细胞分离
• 2.2.6.2 软骨细胞单层培养及传代
• 第三章 结果与分析
• 3.1 FGFR2RNAi小鼠基因鉴定结果
• 3.2 分析
• 3.3 Coll2a-Cre小鼠鉴定结果
• 3.3.1 PCR产物凝胶电泳
• 3.3.2 分析
• 3.4 双转基因小鼠基因型鉴定结果
• 3.4.1 PCR产物凝胶电泳
• 3.4.2 PCR产物纯化、测序结果
• 3.4.3 测序结果的BLAST比对结果
• 3.4.4 分析
• 3.5 双转基因小鼠和同窝对照小鼠在形态上的区别结果
• 3.5.1 出生11天的雌性小鼠形态观察结果
• 3.5.2 出生21天的雄性小鼠形态观察结果
• 3.5.3 小鼠体重与时间关系图
• 3.5.3.1 雌性小鼠体重与时间关系图
• 3.5.3.2 雄性小鼠体重与时间关
• 3.5.4 统计学分析结果
• 3.6 双转基因小鼠与同窝对照小鼠生长板切片图观察结果
• 3.6.1 出生11天的雌性小鼠生长板切片图观察结果
• 3.6.2 出生21天的雄性小鼠生长板切片图观察结果
• 3.6.3 统计学分析结果
• 3.7 结果分析
• 3.8 软骨细胞培养及RT-PCR结果
• 3.8.1 软骨细胞分离
• 3.8.2 细胞培养液
• 3.8.3 软骨细胞单层培养及传代结果
• 3.8.4 细胞RNA的提取
• 3.8.5 RT
• 3.8.6 设计的引物BLAST比对结果
• 3.8.7 RT-PCR结果
• 3.8.8 结果分析
• 第四章 讨论
• 4.1 RNAi小鼠基因型的鉴定
• 4.2 双转基因小鼠基因型的鉴定
• 4.3 细胞体外培养分析
• 4.4 骨形成分析
• 第五章 结论展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C
• 致谢
• 读研期间取得研究成果