大肠杆菌生产药物蛋白的系统优化研究

论文摘要

大肠杆菌表达系统是基因工程中应用最广泛的也是最有效的表达重组蛋白的系统。大肠杆菌是目前遗传和生化背景最清晰的有机体,它良好的研究背景、易生长易操作的优点使其成为表达外源蛋白的首选系统。用传统方法难以制取的蛋白质、细胞因子等新型药物可以在大肠杆菌中大量表达生产。目前很多商品化的药用蛋白如胰岛素、干扰素、生长因子等都是用大肠杆菌系统生产的,占所有药用蛋白的三分之一。促红细胞生成素（EPO）是由肾脏和肝脏分泌的能促进红细胞生成的激素。利用基因工程研制成功的重组人红细胞生成素（rhEPO）价格相对较低,用于治疗肾性贫血取得了令人瞩目的疗效。干扰素-β（Interferon-β）是由成纤维细胞受病毒感染或IFN诱生所产生的一类具有生物活性的糖蛋白,能通过与靶细胞表面受体结合干扰人体内病毒复制和繁殖,是一种临床治疗病毒性疾病和肿瘤的有效生物反应调节剂。本实验对大肠杆菌表达系统中宿主菌、质粒和表达条件进行优化,选择EPO和IFN-β作为目的蛋白。在宿主菌的选择上,用大肠杆菌λDE3溶原菌BL21（DE3）和能编码表达少量T7溶菌酶的BL21（DE3）/pLys两种菌株。载体在pET系列表达载体上中筛选。同时为消除稀有密码子对表达的影响,目的蛋白EPO和IFN-β的基因用化学合成的方法得到。在表达条件的筛选上,用正交试验设计确定各种表达条件的影响。构建成功的表达载体在宿主菌中诱导后,经SDS-PAGE电泳检测,EPO和IFN-β表达量均在20%以上。正交试验结果分析后,选定0.8M IPTG、OD550为0.9、诱导时间4h作最佳诱导表达条件。试验结果表明,我们已经获得了大量表达EPO和IFN-β的菌株,优化得到最佳表达条件,为在大肠杆菌中表达各种外源药物蛋白打下基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.基因工程制药的研究进展
• 2.重组蛋白药物
• 2.1 重组蛋白药物的生产原理
• 2.2 重组蛋白药物的市场
• 2.3 重组蛋白药物的表达系统
• 2.3.1 真核生物表达系统
• 2.3.2 原核生物表达系统
• 2.4 几种重组蛋白药物
• 2.4.1 促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）
• 2.4.2 干扰素-β（Interferon-β,IFN-β）
• 3.蛋白质修饰的研究
• 4.本论文的研究目的和意义
• 实验部分
• 1.实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 分子克隆用酶和试剂
• 1.3 培养基与溶液
• 1.4 引物
• 1.5 基因合成
• 2.实验方法
• 2.1 促红细胞生成素（EPO）在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达纯化
• 2.1.1 EPO全基因合成
• 2.1.2 pET22b/EPO表达载体的构建
• 2.1.3 pET15b/EPO表达载体的构建
• 2.1.4 pT7-7/EPO表达载体的构建
• 2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.6 连接产物的大肠杆菌转化
• 2.1.7 重组质粒的制备
• 2.1.8 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.1.9 促红细胞生成素（EPO）在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达
• 2.1.10 目的蛋白的大量制备
• 2.1.11 包涵体的处理
• 2.2 干扰素-β（IFN-β）在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达
• 2.2.1 IFN-β全基因合成
• 2.2.2 pET15b/IFN-β表达载体的构建
• 2.2.3 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.2.4 IFN-β在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达
• 3.实验结果
• 3.1 促红细胞生成素（EPO）在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达
• 3.1.1 EPO全基因合成
• 3.1.2 表达载体pET22b/EPO的构建
• 3.1.3 表达载体pET15b/EPO的构建
• 3.1.4 表达载体pT7-7/EPO的构建
• 3.1.5 促红细胞生成素的诱导表达
• 3.1.6 表达条件的优化
• 3.1.7 包涵体的复性和纯化
• 3.1.8 复性EPO蛋白的纯化和分析
• 3.2 干扰素-β（IFN-β）在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达
• 3.2.1 干扰素-β（IFN-β）基因的合成
• 3.2.2 表达载体pET15b/IFN-β的构建
• 3.2.3 干扰素-β（IFN-β）的诱导表达
• 讨论
• 1.基因的合成
• 2.表达载体及宿主的选择
• 3.表达条件的优化
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表