活细胞内脊髓灰质炎病毒复制复合体蛋白相互作用研究

论文摘要

脊髓灰质炎病毒为单股正链RNA病毒。当病毒基因组RNA进入寄主细胞质后，可直接翻译出大分子的多聚蛋白肽，并迅速被水解加工为次级前体P1，P2和P3，然后三个次级前体分别进一步分级剪切成多种具有重要功能的终末产物蛋白。一些病毒蛋白和宿主蛋白以及病毒的RNA一起组成病毒复制复合体，高效迅速地指导病毒核酸的合成。其中P3的剪切产物3AB，3B（VPg），3D等在病毒的复制复合体的组成及功能行使中具有重要作用：3B（VPg）共价结合于RNA新生链的5’端，起RNA合成起始引发作用；3D是延长RNA新生链的聚合酶；3AB是膜结合蛋白，帮助病毒复制复合体定位于细胞内膜上。研究脊髓灰质炎病毒复制复合体内关键蛋白间相互作用，阐明病毒复制复合体的作用机制，对揭示病毒复制机理以及理解病毒与寄主细胞间相互作用具有重要意义。迄今为止，已经发展了许多蛋白质相互作用的研究方法如：酵母双杂交、免疫共沉淀、SPR等。但这些方法都无法实现蛋白质相互作用的原位、活体、实时研究。荧光共振能量转移技术是一种在活细胞内研究蛋白质相互作用的新技术，可以在活体内原位、无损地可视化蛋白-蛋白间相互作用。本研究利用荧光共振能量转移技术，首次在活细胞内可视化研究了脊髓灰质炎病毒复制复合体内关键蛋白质间的相互作用。本论文主要研究了脊髓灰质炎病毒复制复合体内三种关键蛋白质3AB、VPg、3D在活细胞内的定位和相互作用情况。利用激光共聚焦显微镜和FRET技术分析样品。单独转染实验显示：3AB蛋白主要分布在细胞质区域，且聚集成小的不规则的颗粒；而VPg和3D蛋白主要均匀分布于全细胞。蛋白的共转染实验显示：3AB-VPg这组蛋白在活细胞中可相互作用，且作用区域集中在细胞质，分析结果显示FRET效率平均值为8.3±0.6％（n=44）；同时3AB-3D这组蛋白在活细胞中也可相互作用，且作用区域集中在细胞质，分析结果显示FRET效率平均值为6.1±0.8％（n=46）；而VPg-3D这组蛋白在活细胞中虽然可观察到明显的相互作用，但作用区域分散在整个细胞，没有特别集中的区域，分析结果显示FRET效率平均值为6.8±0.5％（n=51）。可见有3AB蛋白参与的两组相互作用区域集中在细胞质区域，与病毒复制复合体产生位置类似。此外，通过脊髓灰质炎病毒的感染实验，我们发现病毒的感染对3AB-VPg、3AB-3D这两组蛋白间相互作用无明显影响，但是却加强了蛋白VPg和3D间的相互作用，使FRET效率的平均值从6.8±0.5％（n=51）上升为11.1±1.1％（n=43）。借助荧光蛋白标记和荧光共振能量转移技术，本论文研究了脊髓灰质炎病毒复制复合体内三种关键蛋白质3AB、VPg、3D在活细胞内的定位和相互作用。活细胞内蛋白质3AB、VPg、3D相互作用的研究结果证明了它们在脊髓灰质炎病毒的复制复合体形成中的重要作用，为深入认识病毒复制复合体的形成和作用机制，阐明病毒复制机理提供了重要的数据资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1 脊髓灰质炎病毒及其复制机理模式及复制相关蛋白的研究
• 1.1 脊髓灰质炎病毒简介
• 1.2 脊髓灰质炎病毒的复制模式
• 1.3 病毒复制复合体与病毒复制相关蛋白的研究
• 1.3.1 病毒复制复合体的形成
• 1.3.2 病毒复制相关蛋白的研究
• 1.3.2.1 病毒基因组P3区域的重要蛋白性质
• 2 蛋白质相互作用研究进展
• 2.1 酵母和细菌双杂交系统
• 2.2 免疫共沉淀分析技术
• 2.3 噬菌体展示技术
• 2.4 串联亲和纯化
• 2.5 质谱技术
• 2.6 蛋白质芯片技术
• 2.7 表面等离子共振技术
• 2.8 基于生物信息学的分析法
• 2.9 FRET方法
• 3 本研究的主要目的及研究内容
• 第2章 活细胞内脊髓灰质炎病毒复制复合体蛋白相互作用研究
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 病毒株和细胞株
• 1.3 主要试剂及来源
• 1.4 培养基
• 1.5 培养液及配方
• 1.6 主要溶液与缓冲液
• 1.6.1 质粒DNA的小量制备
• 1.6.2 蛋白质纯化所用缓冲液
• 1.6.3 Tricine-SDS PAGE电泳所用溶液
• 1.6.4 Western blot所用溶液
• 1.6.5 细胞培养所用溶液
• 1.7 分子量标准
• 1.8 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养和病毒的增殖
• 2.2 病毒浓缩和RNA的提取
• 2.3 大肠杆菌质粒的提取
• 2.4 质粒和克隆
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 RT-PCR反应体系
• 2.4.3 融合蛋白质粒构建示意图
• 2.5 感受态细胞的制备
• 2.6 大肠杆菌的转化
• 2.7 重组质粒的筛选、验证
• 2.8 Western blot检测流程
• 2.9 活细胞成像及FRET分析
• 3 结果与分析
• 3.1 3AB、VPg、3D和ECFP、EYFP基因的扩增
• 3.2 重组质粒的验证
• 3.3 3AB和VPg在活细胞内的相互作用成像
• 3.4 VPg和3D在活细胞内的相互作用成像
• 3.5 3AB和3D在活细胞内的相互作用成像
• 3.6 病毒侵染对3AB-3D,3D-Vpg和3AB-VPg三组蛋白相互作用的影响
• 3.7 对照样品的FRET分析
• 3.7.1 阳性对照的FRET分析
• 3.7.2 阴性对照的FRET分析
• 4 讨论
• 第3章 结论
• 参考文献
• 发表和待发表的文章
• 致谢