未折叠蛋白反应在白内障发病机制中作用的实验研究

论文摘要

目的自1972年Kerr首次发现细胞凋亡以来,有关细胞凋亡与白内障的关系一直在探讨中。目前认为晶状体上皮细胞的凋亡是除先天性白内障以外所有类型白内障形成的细胞学基础。研究晶状体上皮细胞的凋亡机制成为研究各型白内障形成机制的热点。内质网是细胞内蛋白质折叠的场所,在低氧、葡萄糖饥饿、氧化及糖基化作用紊乱等内质网刺激因子作用下,大量未折叠蛋白在内质网中堆积,产生一条称为未折叠蛋白反应的自我保护信号转导通路,应激信号通过内质网传送进入细胞核中,最终使细胞产生生存适应或诱导细胞凋亡。因此未折叠蛋白反应在应激细胞的转归中起重要作用。本课题通过内质网应激刺激因子作用于晶状体上皮细胞,试图了解内质网应激导致的未折叠蛋白反应是否诱导晶状体上皮细胞的凋亡,从而探讨未折叠蛋白反应与白内障发病机制的关系。方法将晶状体上皮细胞分为对照组和实验组A、B、C、D组,分别用0、1、2、5、10mmol/L的同型半胱氨酸（Hcy）作用于细胞24小时。应用MTT法检测不同浓度药物刺激后的细胞增殖抑制率;应用Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡率;应用活性氧荧光探针DCFH-DA检测刺激后细胞中活性氧产物（ROS）;应用GSH检测试剂盒检测刺激后细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量;应用Western blot技术检测刺激后细胞中的GRP78,caspase-12的表达。结果1.不同浓度同型半胱氨酸对细胞增殖抑制率的影响:Hey刺激细胞24h后,显微镜下可见对照组、实验A、B组细胞均贴壁生长,形态无明显变化;实验C、D组细胞可见部分漂浮,其中D组细胞贴壁少,细胞死亡过半。细胞活力呈浓度依赖性下降,其中5mmol/L,10mmol/LHcy可使细胞活性下降48.3%,57.7%,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。2.不同浓度同型半胱氨酸对细胞凋亡的影响:荧光显微镜下可见对照组与实验A、B组细胞无明显凋亡发生,核呈弥散均匀的蓝色荧光,实验C组细胞体积缩小,核凝聚变小,核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光,且荧光强度比正常细胞要强。实验D组由于细胞贴壁少,无荧光结果显示。3.不同浓度同型半胱氨酸对细胞内ROS形成的影响:荧光显微镜下可见,对照组细胞基本无荧光显现,实验组均可见绿色荧光,且荧光强度呈浓度依赖性增加。流式细胞仪检测的细胞内DCF荧光强度的变化经统计学分析表明,与对照组相比,实验A、B组的ROS水平的升高无统计学意义（P＞0.05）,而实验C、D组的ROS水平显著升高（P＜0.05）。4.不同浓度同型半胱氨酸对细胞内GSH的影响:细胞内的GSH含量随刺激浓度的增加呈浓度依赖性减少。实验A、B组与对照组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;实验C、D组GSH显著减少（P＜0.05）。5.细胞内GRP78,caspase-12的表达:实验组C、D组GRP78蛋白含量较对照组明显增加,分别为对照组的4.6倍和6.9倍,同时伴随Caspase-12表达增加,分别为对照组的2.8倍和3.1倍（P＜0.05）;而实验组A、B各指标虽有类似趋势但变化程度较小,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1.Hcy可诱发晶状体上皮细胞产生内质网应激。2.低浓度的内质网刺激因子会干扰晶状体上皮细胞内质网稳态,影响蛋白正确修饰与折叠,异常蛋白增多,但通过未折叠蛋白反应的保护作用,细胞中的未折叠蛋白得以清除,细胞产生生存适应。3.高浓度的内质网刺激因子可刺激晶状体上皮细胞产生内质网应激,并通过未折叠蛋白反应导致晶状体上皮细胞凋亡,产生白内障。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
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• 学位论文评阅及答辩情况表