低乙醇脱氢酶Ⅱ活性的抗老化啤酒酵母工程菌的构建

论文摘要

乙醛是啤酒中的主要风味物质之一,低浓度的乙醛使啤酒具有芳香味,高浓度则产生像青草或者苹果腐烂的味道。以国内啤酒为例,乙醛含量多在5-12 mg/L,而国外优质啤酒的乙醛含量多在3 mg/L以下。目前,国内啤酒生产中控制乙醛含量采用的方法主要是生产工艺改良,但实际效果并不明显。乙醛含量已经成为国内啤酒风味改良的瓶颈,一直难有突破。随着基因重组技术的发展,在基因水平上对酿酒酵母进行修饰,最终实现降低乙醛含量的目的已经成为可能。本文利用自克隆技术,构建了一株新型啤酒酵母工程菌,并对其进行了小型发酵试验,检测了重要的产物含量和发酵指标。实验主要内容和结果见下:根据文献报道的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）乙醇脱氢酶Ⅱ（ADH2）基因序列设计引物,以YSF31的总DNA为模板进行PCR扩增,获得ADH2基因及其上游700bp序列的一段DNA片段,将该片段插入到质粒YEp352上,构建了重组克隆质粒pYA。将筛选标记基因CUP1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1插入到质粒pYA的ADH2基因中,构建了重组质粒pACG。用PvuⅡ酶切重组质粒pACG得到一个DNA片段:含有铜抗性基因CUP1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1,两端含有ADH2基因的5’端和3’端序列。用此DNA片段转化啤酒酵母YSF31,使该片段与染色体在ADH2位点发生同源重组。通过细胞对硫酸铜的抗性筛选到转化子。经PCR验证,片段成功重组到受体菌的染色体上。由于遗传操作引入的基因片段都是来源于酵母自身,故该工程菌被称为自克隆菌株。对受体菌和自克隆菌株的铜抗性进行测定,结果显示受体菌和自克隆菌株在含有5mmol/L CuSO4YEPD培养基上都能生长,受体菌在含有6mmol/L CuSO4的YEPD培养基上就不能生长。而自克隆菌株在含有6mmol/L,7mmol/L,8mmol/L CuSO4的YEPD培养基上均能生长。经检测,自克隆菌株的铜抗性达到8.5mmol/L的Cu2+浓度。对受体菌和自克隆菌株的GSH含量进行测定。结果显示,在酵母胞内自克隆菌株的GSH含量比受体菌高15%;在发酵液中自克隆菌株的GSH含量比受体菌高42%。铜抗性和GSH含量测定的结果说明,CUP1基因和GSH1基因被重组到受体菌的染色体上,并成功共表达。对受体菌和自克隆菌株进行的小型发酵试验结果显示,发酵液中的谷胱甘肽含量,自克隆菌株比受体菌YSF31高34%。而ADH2基因的破坏,使ADHⅡ酶活性明显降低,自克隆菌株的酶活是受体菌的65%。自克隆菌株的其它发酵指标如α-N氨基酸同化率、真正发酵度等与受体菌基本相同。由CO2减重实验和真正发酵度的检测结果可以看出,自克隆菌株的发酵速度和发酵度基本没有发生变化,说明遗传修饰没有影响酵母的发酵能力。本研究采用自克隆技术,首次将啤酒酵母工业菌株中的ADH2基因敲除,同时在该位点插入一个CUP1基因和GSH1基因,获得了低ADHⅡ酶活性高GSH含量的啤酒酵母工程菌,为构建低乙醛抗老化的啤酒酵母工程菌奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 引言及文献综述
• 引言
• 1 构建乙醛生成量少的转基因酵母
• 1.1 乙醛的性质及测定方法
• 1.2 乙醛的代谢
• 1.3 关于控制啤酒中乙醛含量的研究进展
• 2 酿酒酵母中谷胱甘肽合成酶基因的研究进展
• 2.1 谷胱甘肽的性质、分布与合成
• 2.2 谷胱甘肽在生物体内的功能
• 2.3 谷胱甘肽在工业酵母中的应用
• 2.4 谷胱甘肽代谢途径相关基因介绍及其基因工程研究进展
• 第二部分 研究内容
• 1 实验材料
• 1.1 实验菌株和质粒
• 1.2 培养基和培养条件
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 缓冲液与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 酵母总DNA的提取
• 2.2 引物设计和合成
• 2.3 质粒的限制性酶切和连接转化
• 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.5 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.6 重组质粒的酶切验证
• 2.7 低熔点胶琼脂糖凝胶电泳纯化回收DNA片段
• 2.8 酵母菌完整细胞转化
• 2.9 酵母转化子稳定性检测
• 2.10 小型发酵实验中酵母菌的前期培养
• 2.11 细胞中GSH含量测定
• 2.12 发酵液中GSH含量测定
• 2.13 乙醇脱氢酶Ⅱ活性测定
• 2.14 蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝法
• 2.15 酵母凝聚性的测定
• 2.16 α—N的测定
• 2.17 二氧化碳减重
• 2.18 PH值的测定
• 2.19 发酵度的测定
• 2.20 其他
• 3 结果和分析
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.1.1 ADH2基因的PCR扩增
• 3.1.2 重组质粒PYA的构建
• 3.1.3 重组质粒PACG的构建
• 3.2 工程菌的构建
• 3.3 工程菌的验证
• 3.3.1 PCR扩增验证
• 3.3.2 谷胱甘肽含量检测
• 3.3.3 铜抗性检测
• 3.3.4 ADH 11酶活性测定
• 3.4 遗传稳定性分析
• 3.5 小型发酵实验
• 4 结论和讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章列表