本文主要研究内容
作者宋金奇（2019）在《利用杆状病毒表达系统组装H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的研究》一文中研究指出：2013年,我国华东地区出现了新型H7N9禽流感病毒疫情。截止到2017年,我国累计报告人感染H7N9禽流感病例共1398例,死亡约500人,病例覆盖我国20多个省市地区。尽管国家采取了一系列的疾病防控措施,但是H7N9禽流感病毒致人发病的病例至今仍有散在发生。面对如此严峻的形势,对于安全且高效的新型禽流感疫苗的研制开发,成为H7N9亚型禽流感防控的关键。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一种新型的基因工程疫苗,它具有安全性高、免疫效果好以及不易失活等优点,使其在病毒疫苗开发中具有重要的研究意义。目前全世界已有大量关于VLPs的研究报道,其中人类乳头瘤病毒样颗粒(HPV VLPs)疫苗已经成功上市,预示着病毒样颗粒疫苗具有广阔的市场前景。禽流感病毒样颗粒疫苗不含病毒核酸,使用时没有生物安全风险,而且可以诱导细胞免疫并对同型的异源病毒提供免疫保护,是目前最有希望替代现有禽流感疫苗的候选疫苗。因此,禽流感病毒样颗粒疫苗的研制具有极为重要的科学价值和社会效益。本研究首先对我国H7N9亚型禽流感病毒流行状况进行广泛流行病学调查,然后在此基础上筛选出流行毒株作为疫苗用毒株,将其主要结构蛋白HA基因、NA基因和M1基因进行密码子优化和全基因合成作为抗原基因,然后将HA基因和M1基因通过常规酶切克隆方法连接到pYBDM-IM转移载体中,将NA基因通过常规酶切克隆方法连接到pUCDM-XIGP转移载体中,将得到的重组转移载体通过酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳发现特异性目的条带,说明重组转移载体已经构建成功,并将其测序进一步验证抗原基因是否正确。将验证正确的两种转移载体pYBDM-IM-HA-M1和pUCDM-XIGP-NA,通过转座和位点特异性重组的方法同时重组到SW106Am/asd~-/InvC~+感受态细胞中,采取抗性筛选、蓝白斑筛选和菌液PCR等方法筛选阳性重组菌液,将得到的阳性重组菌液命名为Am-HA-NA-M1-IM-XIGP。将重组菌液采用本实验室建立的细菌感染方法直接感染Sf9昆虫细胞,收获重组病毒BV-HA-NA-M1-IM-XIGP,因为重组病毒同时携带GFP和mCherry两种报告基因,因此在荧光显微镜下可以同时观察到红色荧光和绿色荧光。收集病毒感染的Sf9细胞上清提取病毒基因组DNA,并利用设计的特异性引物进行检测,结果表明基因组DNA均PCR扩增出特异性目的条带,这说明HA基因、NA基因和M1基因已经成功重组至杆状病毒基因组中;另外,收集病毒感染的Sf9细胞沉淀进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定,用三种目的基因各自携带标签的特异性抗体检测HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白的表达情况,结果发现63KD、53KD和29KD的蛋白条带,说明H7N9亚型禽流感的HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白在Sf9昆虫细胞中成功得到表达。将重组病毒大量感染Sf9昆虫细胞,5天后收集病毒感染细胞进行蛋白质纯化,然后将纯化的蛋白质置于透射电子显微镜下进行观察,结果发现直径大小为80~120nm的病毒样颗粒结构。这说明,M1、NA和HA蛋白在Sf9昆虫细胞中得到了很好地表达,并且组装成了VLPs结构。这进一步说明了,本研究成功利用杆状病毒表达系统生产了H7N9亚型禽流感病毒样颗粒,为以后生产和制备H7N9亚型禽流感疫苗提供了技术支撑。
Abstract
2013nian ,wo guo hua dong de ou chu xian le xin xing H7N9qin liu gan bing du yi qing 。jie zhi dao 2017nian ,wo guo lei ji bao gao ren gan ran H7N9qin liu gan bing li gong 1398li ,si wang yao 500ren ,bing li fu gai wo guo 20duo ge sheng shi de ou 。jin guan guo jia cai qu le yi ji lie de ji bing fang kong cuo shi ,dan shi H7N9qin liu gan bing du zhi ren fa bing de bing li zhi jin reng you san zai fa sheng 。mian dui ru ci yan jun de xing shi ,dui yu an quan ju gao xiao de xin xing qin liu gan yi miao de yan zhi kai fa ,cheng wei H7N9ya xing qin liu gan fang kong de guan jian 。bing du yang ke li (Virus-like particles,VLPs)shi yi chong xin xing de ji yin gong cheng yi miao ,ta ju you an quan xing gao 、mian yi xiao guo hao yi ji bu yi shi huo deng you dian ,shi ji zai bing du yi miao kai fa zhong ju you chong yao de yan jiu yi yi 。mu qian quan shi jie yi you da liang guan yu VLPsde yan jiu bao dao ,ji zhong ren lei ru tou liu bing du yang ke li (HPV VLPs)yi miao yi jing cheng gong shang shi ,yu shi zhao bing du yang ke li yi miao ju you an kuo de shi chang qian jing 。qin liu gan bing du yang ke li yi miao bu han bing du he suan ,shi yong shi mei you sheng wu an quan feng xian ,er ju ke yi you dao xi bao mian yi bing dui tong xing de yi yuan bing du di gong mian yi bao hu ,shi mu qian zui you xi wang ti dai xian you qin liu gan yi miao de hou shua yi miao 。yin ci ,qin liu gan bing du yang ke li yi miao de yan zhi ju you ji wei chong yao de ke xue jia zhi he she hui xiao yi 。ben yan jiu shou xian dui wo guo H7N9ya xing qin liu gan bing du liu hang zhuang kuang jin hang an fan liu hang bing xue diao cha ,ran hou zai ci ji chu shang shai shua chu liu hang du zhu zuo wei yi miao yong du zhu ,jiang ji zhu yao jie gou dan bai HAji yin 、NAji yin he M1ji yin jin hang mi ma zi you hua he quan ji yin ge cheng zuo wei kang yuan ji yin ,ran hou jiang HAji yin he M1ji yin tong guo chang gui mei qie ke long fang fa lian jie dao pYBDM-IMzhuai yi zai ti zhong ,jiang NAji yin tong guo chang gui mei qie ke long fang fa lian jie dao pUCDM-XIGPzhuai yi zai ti zhong ,jiang de dao de chong zu zhuai yi zai ti tong guo mei qie jian ding ,qiong zhi tang ning jiao dian yong fa xian te yi xing mu de tiao dai ,shui ming chong zu zhuai yi zai ti yi jing gou jian cheng gong ,bing jiang ji ce xu jin yi bu yan zheng kang yuan ji yin shi fou zheng que 。jiang yan zheng zheng que de liang chong zhuai yi zai ti pYBDM-IM-HA-M1he pUCDM-XIGP-NA,tong guo zhuai zuo he wei dian te yi xing chong zu de fang fa tong shi chong zu dao SW106Am/asd~-/InvC~+gan shou tai xi bao zhong ,cai qu kang xing shai shua 、lan bai ban shai shua he jun ye PCRdeng fang fa shai shua yang xing chong zu jun ye ,jiang de dao de yang xing chong zu jun ye ming ming wei Am-HA-NA-M1-IM-XIGP。jiang chong zu jun ye cai yong ben shi yan shi jian li de xi jun gan ran fang fa zhi jie gan ran Sf9kun chong xi bao ,shou huo chong zu bing du BV-HA-NA-M1-IM-XIGP,yin wei chong zu bing du tong shi xie dai GFPhe mCherryliang chong bao gao ji yin ,yin ci zai ying guang xian wei jing xia ke yi tong shi guan cha dao gong se ying guang he lu se ying guang 。shou ji bing du gan ran de Sf9xi bao shang qing di qu bing du ji yin zu DNA,bing li yong she ji de te yi xing yin wu jin hang jian ce ,jie guo biao ming ji yin zu DNAjun PCRkuo zeng chu te yi xing mu de tiao dai ,zhe shui ming HAji yin 、NAji yin he M1ji yin yi jing cheng gong chong zu zhi gan zhuang bing du ji yin zu zhong ;ling wai ,shou ji bing du gan ran de Sf9xi bao chen dian jin hang SDS-PAGEdian yong he Western blotjian ding ,yong san chong mu de ji yin ge zi xie dai biao qian de te yi xing kang ti jian ce HAdan bai 、NAdan bai he M1dan bai de biao da qing kuang ,jie guo fa xian 63KD、53KDhe 29KDde dan bai tiao dai ,shui ming H7N9ya xing qin liu gan de HAdan bai 、NAdan bai he M1dan bai zai Sf9kun chong xi bao zhong cheng gong de dao biao da 。jiang chong zu bing du da liang gan ran Sf9kun chong xi bao ,5tian hou shou ji bing du gan ran xi bao jin hang dan bai zhi chun hua ,ran hou jiang chun hua de dan bai zhi zhi yu tou she dian zi xian wei jing xia jin hang guan cha ,jie guo fa xian zhi jing da xiao wei 80~120nmde bing du yang ke li jie gou 。zhe shui ming ,M1、NAhe HAdan bai zai Sf9kun chong xi bao zhong de dao le hen hao de biao da ,bing ju zu zhuang cheng le VLPsjie gou 。zhe jin yi bu shui ming le ,ben yan jiu cheng gong li yong gan zhuang bing du biao da ji tong sheng chan le H7N9ya xing qin liu gan bing du yang ke li ,wei yi hou sheng chan he zhi bei H7N9ya xing qin liu gan yi miao di gong le ji shu zhi cheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自南阳师范学院的宋金奇，发表于刊物南阳师范学院2019-07-10论文，是一篇关于禽流感论文,病毒样颗粒论文,南阳师范学院2019-07-10论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自南阳师范学院2019-07-10论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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