侵染东亚飞蝗翅膀的金龟子绿僵菌在附着胞形成分化阶段均一化cDNA文库的构建与分析

论文摘要

金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,专一性好,无环境污染,但存在着杀虫速率慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。金龟子绿僵菌侵染寄主昆虫时,孢子萌发后会形成附着胞——一种重要的侵染器官,能够分泌多种蛋白酶降解昆虫体壁,并产生膨胀压帮助侵染钉刺穿体壁。附着胞的形成及分化在金龟子绿僵菌侵染过程中发挥着重要作用,对这一阶段病原真菌的致病机制进行研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。国内外许多研究者对绿僵菌侵染昆虫体表阶段的基因表达进行了深入研究,采用的方法是往液体培养基中加入昆虫表皮提取物后培养绿僵菌,然后构建绿僵菌的cDNA文库进行EST测序分析。绿僵菌在离体的液体培养环境下生长时处于腐生生活阶段,而绿僵菌在侵染昆虫体表时处于寄生生活阶段,在这两种条件下生长的绿僵菌的基因表达肯定会存在较大差别。本文以生长于东亚飞蝗翅膀,且处于附着胞形成分化阶段的金龟子绿僵菌CQMa102为实验材料,成功构建了绿僵菌的cDNA文库,为深入揭示病原真菌的侵染机制提供有力的技术支撑。为保证构建的cDNA文库不含寄主蝗虫的克隆,本研究中采用RNA fragmentation buffer降解东亚飞蝗翅膀所含的核酸,并且设计了蝗虫特异性引物,利用RT-PCR反应建立监控体系保证构建文库的cDNA不被蝗虫序列污染。观察比较金龟子绿僵菌CQMa102在处理与未处理翅膀上的萌发分化过程,发现降解蝗虫翅膀核酸的处理方法不会影响绿僵菌在翅膀上的生长。测序分析构建的cDNA文库获得了221条EST序列,没有发现蝗虫的序列存在,并且发现了一些具有代表性的、与绿僵菌侵染相关的基因。主要研究结果如下:1.使用试剂RNA fragmentation buffer处理东亚飞蝗翅膀后,分别提取翅膀的DNA和total RNA,发现DNA与total RNA都已明显降解。2.根据已报道的蝗虫组成型表达及高表达基因设计了灵敏度较高的特异性引物,用于RT-PCR检测构建文库的cDNA是否含有蝗虫序列,检测结果表明cDNA不含蝗虫DNA或RNA;3.采用数码生物显微镜观察了绿僵菌CQMa102在东亚飞蝗翅膀上萌发分化过程,发现8 h左右孢子开始萌发,16 h附着胞开始形成,20 h大部分孢子已经萌发,30 h附着胞大量形成,并有极少量的穿透钉形成;比较了绿僵菌CQMa102在处理与未处理翅膀生长行为,发现差异不显著。4.以构建文库的cDNA为模板,通过PCR扩增得到了金龟子绿僵菌CQMa102侵染阶段特异表达的基因Mad1,Mpl1和Pr1A,表明cDNA包含已报道的绿僵菌毒力基因,具有一定代表性。5.采用DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术与SMART建库技术相结合的方法,成功构建了生长于蝗虫翅膀且处于附着胞形成分化时期的金龟子绿僵菌CQMa102 cDNA文库。通过随机测序文库克隆,获得了高质量的EST序列221条,共代表162条unigene,其比率为73.3%,表明文库的均一化效果较好;将EST序列与蝗虫EST数据库进行blast比对,没有发现EST序列与蝗虫序列显示高相似性,表明构建的cDNA文库只包含绿僵菌CQMa102的表达基因,而不含有宿主蝗虫的序列。6.在GenBank上用BlastX对162条unigene进行序列相似性比对。结果表明93条unigene的编码产物与NCBI蛋白数据库中已知功能蛋白存在较高相似性,66条与未知功能蛋白存在较高相似性,还有3条没有任何找到任何相似性。93条功能已知的同源EST序列涉及多种代谢和应答过程,如蛋白质合成加工、细胞代谢、RNA代谢、细胞周期相关蛋白、胁迫及防御相关蛋白等。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 绿僵菌的研究进展
• 1.2.1 分类与寄主范围
• 1.2.2 生物化学和分子生物学研究
• 1.2.3 病原真菌侵染寄主昆虫的过程
• 1.3 附着胞研究概况
• 1.3.1 附着胞的形态结构
• 1.3.2 附着胞形成假说
• 1.3.3 附着胞形成的相关信号转导
• 1.3.4 附着胞的主要功能
• 1.4 均一化技术的研究现状
• 1.4.1 常用的均一化技术
• 1.4.2 基于DSN 的均一化技术
• 1.5 立题依据和研究目标
• 1.6 研究内容和技术路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 1.7 本研究创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株和昆虫
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.2 东亚飞蝗翅膀核酸的降解
• 2.2.1 东亚飞蝗翅膀核酸的提取
• 2.2.2 降解翅膀total RNA 条件的优化
• 2.2.3 东亚飞蝗翅膀的处理
• 2.3 金龟子绿僵菌在东亚飞蝗翅膀上的生长过程
• 2.3.1 供试菌株培养及分生孢子悬浮液制备
• 2.3.2 分生孢子悬浮液接种东亚飞蝗翅膀
• 2.3.3 孢子萌发率与附着胞形成率的测定
• 2.3.4 处理翅膀与未处理翅膀上金龟子绿僵菌生长行为的比较
• 2.4 金龟子绿僵菌附着胞形成分化时期均一化cDNA 文库的构建
• 2.4.1 金龟子绿僵菌的培养和收集
• 2.4.2 mRNA 的提取
• 2.4.3 cDNA 第一链的合成
• 2.4.5 cDNA 的均一化
• 2.4.6 东亚飞蝗核酸的检测及cDNA 代表性分析
• 2.4.7 cDNA 片段的酶切和分级
• 2.4.8 cDNA 与载体pDNR-Lib 连接
• 2.4.9 电转化
• 2.4.10 文库质量的鉴定
• 2.5 EST 序列分析
• 2.5.1 EST 序列与蝗虫EST 数据库的比对分析
• 2.5.2 EST 序列与绿僵菌EST 序列的比对分析
• 2.5.3 EST 序列功能聚类
• 3 结果和分析
• 3.1 东亚飞蝗翅膀核酸的降解
• 3.1.1 降解条件的优化
• 3.1.2 东亚飞蝗翅膀的处理
• 3.2 金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗翅膀时的生长过程
• 3.2.1 金龟子绿僵菌在翅膀上的萌发与分化
• 3.2.2 金龟子绿僵菌在处理翅膀与未处理翅膀上生长行为的比较
• 3.3 金龟子绿僵菌附着胞形成分化时期均一化cDNA 文库的构建
• 3.3.1 mRNA 的分离、cDNA 的合成及均一化
• 3.3.2 东亚飞蝗引物灵敏度及cDNA 中东亚飞蝗核酸的检测
• 3.3.3 cDNA 代表性分析
• 3.3.4 文库滴度和插入片断大小分析
• 3.4 EST 序列分析与功能聚类
• 4 讨论
• 4.1 金龟子绿僵菌培养基质的选择
• 4.2 东亚飞蝗翅膀核酸的降解方法
• 4.3 均一化cDNA 文库的构建
• 4.4 EST 序列生物信息学分析
• 5 结论与后续工作建议
• 通过对本课题的研究，我们可以得出以下主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录