3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗相关miRNAs的筛选及功能研究

论文摘要

第一部分miRNAs在3T3-L1脂肪细胞和胰岛素抵抗脂肪细胞中的差异表达目的:1.探讨正常3T3-L1脂肪细胞和胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）脂肪细胞中微小RNA（miRNAs）的表达是否存在差异。2.筛选几个可能与IR相关的miRNAs,寻找其靶基因,以进一步研究miRNAs在IR中的作用。方法:1.IR脂肪细胞模型的建立采用高糖/高胰岛素处理3T3-L1脂肪细胞24小时,通过葡萄糖消耗实验和[3H]葡萄糖摄取实验判断模型是否建立。2.miRNAs的差异表达运用miRNAs芯片技术检测3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞中差异表达的miRNAs。3.IR相关的几个miRNAs及其靶基因的筛选根据基因芯片结果,借助生物信息学方法,对显著变化的某些miRNAs进行分析,筛选几个可能与IR相关的miRNAs及其调控的靶基因。结果:1.IR脂肪细胞模型的建立高糖/高胰岛素分别使3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量和[3H]葡萄糖摄取率下降75%和161%,与脂肪细胞组相比差异有显著性,结果表明IR脂肪细胞模型成立。2.miRNAs芯片分析miRNAs芯片结果显示:miRNAs在IR脂肪细胞中比在脂肪细胞中表达水平升高2倍以上者有50个,表达水平降低至1/2以下者有29个;且miR-320上调最明显,miR-21下调最明显。3.IR相关的几个miRNAs及其靶基因应用生物信息学方法,我们选取了3个可能与IR相关的miRNAs（miR-320,298和miR-21）进行下一步的功能实验,Pik3r1可能是他们的靶基因。结论:1.高糖和高胰岛素可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR。2.脂肪细胞和IR脂肪细胞中存在miRNAs的差异表达。第二部分miRNAs对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的调节作用及其分子机制目的:1.针对miR-320和miR-298设计相应的反义寡核苷酸（AMO-miR-320,AMO-miR-298）,同时构建含miR-21前体的重组质粒（pSilencer 3.1-miR-21）。以脂质体为载体介导,观察AMO-miR-320,AMO-miR-298及pSilencer 3.1-miR-21对3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞糖代谢的影响。了解这3个miRNAs在正常和病理状况下有无促进葡萄糖摄取和改善IR的作用。2.对能改善脂肪细胞IR的miRNAs,进一步探讨其作用机制。方法:1.miRNAs对正常及IR脂肪细胞葡萄糖消耗的影响实验分7组:脂肪细胞组、脂质体组、AMO-miR-298组、AMO-miR-320组、miRNA无关对照组（control oligo组）、pSilencer3.1-miR-21组和空质粒组。脂肪细胞转染4-6h小时后,用含0.2%BSA的正常糖/正常胰岛素或高糖/高胰岛素培养液培养24小时,以葡萄糖氧化酶法检测每孔培养液中葡萄糖的含量,与未接种细胞的空白孔的糖含量均值相减,计算葡萄糖的消耗量。2.miRNAs对正常及IR脂肪细胞葡萄糖摄取的影响实验分组及细胞处理同上,24小时后,通过葡萄糖摄取实验检测各组脂肪细胞对葡萄糖摄取的影响。3.miRNAs对IR脂肪细胞PI-3K、Akt、GLUT4的表达和GLUT4转位的影响实验分7组:脂肪细胞组、IR脂肪细胞组（IR组）、AMO-miR-320+IR组、脂质体+IR组、miRNA无关对照+IR组、pSilencer 3.1-miR-21+IR组和空质粒+IR组。实验结束时,通过western-blot检测各组细胞（P1-3K,Akt和GLUT4）的蛋白表达及细胞外膜蛋白中GLUT4蛋白的含量;荧光定量PCR检测P1-3K,Akt和GLUT4基因表达水平。结果:1.miRNAs对正常3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗和摄取的影响基础状态下,3种miRNAs对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗和摄取无显著性影响;在100nmol/L胰岛素存在的条件下,各组脂肪细胞对葡萄糖的消耗和摄取都显著增加,分别是基础状态下的2.2-2.3倍和4.2-4.4倍,但组间无显著性差异。2.miRNAs对IR脂肪细胞葡萄糖消耗和摄取的影响基础状态下,IR组和脂肪细胞组葡萄糖消耗量和摄取率无显著性差异。在100nmol/L胰岛素存在下,与脂肪细胞组相比,IR组葡萄糖消耗量和摄取率显著下降;与IR组比较,AMO-miR-320+IR组和pSilencer 3.1-miR-21+IR组葡萄糖消耗量分别增加了18.5%和14.9%（P＜0.05）,葡萄糖摄取率分别增加了57.3%和46.2%（P＜0.05）;其他各组与IR组相比,葡萄糖消耗量和摄取率无显著性差异。3.miRNAs对IR脂肪细胞PI-3K、Akt、GLUT4的表达和GLUT4转位的影响Western-blot显示:与脂肪细胞组相比,IR组PI3K p85蛋白表达和Akt丝氨酸磷酸化水平分别下降了42.7%和54.8%;AMO-miR-320和miR-21可完全恢复IR脂肪细胞PI3K p85表达;同时使IR脂肪细胞Akt丝氨酸磷酸化水平分别提高28.5%和33.9%。此外,IR组较脂肪细胞组GLUT4蛋白表达显著下降51.1%,AMO-miR-320可使IR脂肪细胞GLUT4蛋白水平提高29.6%;pSilencer 3.1-miR-21+IR组GLUT4蛋白表达水平轻微提高,但与IR组相比无显著性差异。葡萄糖转位分析表明:IR脂肪细胞GLUT4蛋白转位显著降低,仅为正常脂肪细胞的33.7%。我们以IR组GLUT4蛋白转位量作为基值,各组与之相比计算GLUT4蛋白转位的相对定量。AMO-miR-320和miR-21分别使IR脂肪细胞GLUT4蛋白转位增加168.7%和149.4%。荧光定量PCR结果表明:脂肪细胞组PI3K、Akt和GLUT4 mRNA的表达分别是IR组的8.57,16和18.4倍;AMO-miR-320可使IR组Akt和GLUT4 mRNA表达升高4.29和12.1倍,但不影响PI3K mRNA表达水平;miR-21可使IR组PI3K、Akt和GLUT4 mRNA的表达分别提高4.92,6.06和6.96倍。其余各组与IR组相比,上述指标无显著性差异。结论:1.AMO-miR-320和miR-21可促进IR脂肪细胞糖代谢、改善IR。2.AMO-miR-320和miR-21可能是通过作用PI3K P85和PI3KP85上游基因,提高Akt丝氨酸磷酸化水平,促进GLUT4的转位来发挥改善IR的作用。第三部分脂肪细胞分化过程中miRNAs差异表达及功能研究目的:1.探讨3T3-L1前脂肪细胞和间质干细胞（MSC）分化成脂肪细胞过程中差异表达的miRNAs。2.观察miR-320、miR-21和miR-375对3T3-L1脂肪细胞分化的影响;对能影响脂肪细胞分化的miRNAs,进一步探讨其作用机制。方法:1.脂肪细胞分化过程中miRNAs的差异表达分别将3T3-L1前脂肪细胞和分离培养的MSC诱导分化,通过油红O染色检测细胞内脂质蓄积情况、RT-PCR方法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）和脂肪性脂肪酸结合蛋白（aP2）的表达,判断3T3-L1前脂肪细胞和MSC分化情况。运用miRNAs芯片技术检测3T3-L1前脂肪细胞和3T3-L1脂肪细胞;MSC和MSC-脂肪细胞中差异表达的miRNAs。2.脂肪细胞分化相关的miRNAs的筛选及其靶基因的预测根据基因芯片结果,借助生物信息学方法,对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中显著变化的1个miRNA及前面已经证明对脂肪细胞IR有作用的2个miRNAs（miR-320和miR-21）进行靶基因预测。3.miR-21和miR-375对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响构建含miR-21和miR-375前体的重组质粒（pSilencer 3.1-miR-21和pSilencer 3.1-miR-375）,通过脂质体转染法将重组质粒稳定转染3T3-L1细胞。随后将正常和稳定转染的3T3-L1前脂肪细胞诱导分化,实验结束时进行油红O染色,判断脂肪细胞的分化情况。4.AMO-miR-320对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响实验共分4组:分别为3T3-L1对照组、3T3-L1脂肪细胞组、AMO-miR-320组和miRNAs无关对照组。3T3-L1前脂肪细胞常规培养,在诱导分化前分别将AMO-miR-320和无关对照序列转入细胞。转染3天后当细胞生长融合时开始诱导,实验结束时进行油红O染色,判断脂肪细胞的分化情况。5.miR-375促进3T3-L1前脂肪细胞的分化及可能机制为进一步观察miR-375是否促进3T3-L1前脂肪细胞的分化及其可能机制,我们将3T3-L1前脂肪细胞（对照组）和pSilencer3.1-miR-375稳定转染3T3-L1前脂肪细胞（miR-375组）诱导分化,通过RT-PCR实验检测在分化的不同时间（0,3,5,7,9天）aP2和PPARγ2基因表达;高效液相色谱检测脂肪细胞内甘油三酯含量;Western-blot检测分析各实验组ERK1/2、PPARγ2和aP2蛋白的表达。结果:1.miRNAs芯片分析诱导分化结束时,两种脂肪细胞内均含许多脂滴,90%以上的细胞能被油红O染色;且PPARγ2和aP2的基因表达显著增加,这些结果表明3T3-L1前脂肪细胞和MSC分化成成熟的脂肪细胞。芯片结果显示:3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞上调的miRNAs有26个,下调的miRNAs有2个;小鼠MSC分化成脂肪细胞上调的miRNAs有20个,下调的miRNAs有55个。2.脂肪细胞分化相关的miRNAs及其靶基因应用生物信息学方法,我们选择了3个可能与脂肪细胞分化相关的miRNAs（miR-320,21和miR-375）,且MAPK1（ERK2）可能是这3个miRNAs的靶基因。3.miRNAs对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响油红O染色结果表明:miR-375显著增加脂肪细胞的OD值,而miR-21和AMO-miR-320对脂肪细胞的OD值无显著影响,提示miR-375能促进3T3-L1前脂肪细胞分化。4.miR-375促进3T3-L1前脂肪细胞的分化及可能机制RT-PCR结果表明:对照组和miR375组在分化过程中PPARγ2和aP2表达逐日增加;但miR375组从分化的第5天起PPARγ2和aP2表达显著高于对照组。高效液相色谱分析发现:miR375使脂肪细胞内甘油三酯含量显著增加（12.1±0.46 vs 10.8±0.34 mg/mg prot,p＜0.01）。Western-blot结果显示:miR-375使3T3-L1脂肪细胞ERK1和ERK2蛋白分别下降了27.4%和28.2%,PPARγ2和aP2蛋白表达分别提高了49.6%和52.8%（P＜0.01）;空质粒对上述指标无显著影响。结论:1.3T3-L1前脂肪细胞和MSC分化成脂肪细胞过程中存在差异表达的miRNAs。2.miR-375可促进3T3-L1前脂肪细胞分化,其机制可能是通过抑制ERK1/2蛋白的表达、提高PPARγ2和aP2蛋白的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略词简表
• 论文正文
• 前言
• 第一部分 miRNAs在脂肪细胞和胰岛素抵抗脂肪中的差异表达
• 第一章 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立
• 前言
• 1.材料和与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二章 miRNAs在脂肪细胞和胰岛素抵抗脂肪中的差异表达
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 小结
• 第二部分 miRNAs对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的调节作用及分子机制
• 第一章 miRNAs对3T3-L1脂肪细胞和胰岛素抵抗的脂肪细胞糖代谢的影响
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二章 miRNAs改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 小结
• 第三部分 脂肪细胞分化过程中miRNAs差异表达及功能研究
• 第一章 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs的差异表达及功能研究
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二章 小鼠骨髓间充干细胞诱导分化成脂肪细胞过程中miRNA的差异表达
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果