猪精液5mL大管冷冻保存方法的建立及优化

论文摘要

采用手握法采集成年上海白猪精液,收集中段富含精子部分,配制不同的稀释液,在不同条件下进行冻前预处理,并采用不同的冷冻高度进行冷冻,再用不同的解冻方法进行解冻,然后进行体外授精和人工授精试验;同时,还对冷冻前后精液的超微结构进行了电镜观察。结果如下:1.在冷冻Ⅰ液中添加0.1%的N-AcGA（N-Acetyl-D-Glucosamine,N-乙酰-D-氨基葡萄糖）,解冻后精子的活力和顶体完整率最高,分别为50.00%和56.60%;冷冻Ⅱ液中以4%的甘油浓度最好,解冻后精子的活力、质膜完整率和顶体完整率可分别达52.50%、52.08%和77.67%;冷冻液中添加终浓度为10%或20%的卵黄可有效保护精子的活力;在4℃中平衡2h,冻后顶体完整率比对照组（Oh）有显著提高（P＜0.05）;分别选取卵黄（15%和20%）、甘油（1%和1.5%）和OEP（Orvus Es Paste,氨基-钠-十二烷基硫酸脂）（0.5%和1%）两个较好的浓度和平衡时间（0h和2h）相互配伍来进行猪精液冷冻,试验发现,在稀释液中添加15%的卵黄、1%的甘油和0.5%的OEP,平衡2h组可获得较好的活力（35%）和顶体完整率（56.38%）;添加0-0.64mg/mL谷胱甘肽对精子的活力或顶体没有显著的改善。2.选取6个不同的冷冻高度分别冷冻猪5mL大管精液,检测冻后精子的活力、质膜完整性和顶体完整性,结果发现,1cm组冻后活力和顶体完整率最高,分别为55.00%和80.08%;解冻温度分42℃（30s、40s、50s）、52℃（18s、25s、35s、45s）和60℃（20s、30s、40s）共10个组别,试验结果表明,解冻温度和对应的解冻时间对冻后精子的活力影响不明显,顶体完整性却差异显著,以42℃40s组最佳,为59.50%,并在解冻15分钟后精子活力最高,都在0.4以上。3.本试验比较了颗粒、0.25mL细管和5mL大管三种剂型冷冻猪精液的效果,结果发现,5mL大管冻后活力（40%）、活率（49.58%）、质膜完整率（53.91%）和顶体完整率（52.65%）比0.25mL细管低,但差异不显著;采用5mL大管冻后精液和新鲜精液进行IVF试验,无论是在卵裂率,还是桑椹胚或囊胚率上均不存在显著差异（P＞0.05）;本试验还利用颗粒和5mL大管冻后精液进行输精,发现受胎率相当。4。利用扫描电镜技术,研究5mL大管精液超低温冷冻前后猪精子的形态和超微结构,结果发现,冻后精子的顶体膜扣质膜肿胀,大都呈泡状化,部分局部断裂,表明超低温冷冻和升温解冻对猪精子的膜结构损伤严重。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 精液冷冻保存技术研究进展
• 1.1 研究简史
• 1.2 研究现状
• 2 猪精液冷冻保存技术
• 2.1 猪精液冷冻保存技术
• 2.1.1 研究进展
• 2.1.2 猪精子冷冻特点和冷冻机理
• 2.1.3 猪精液冷冻保存的主要技术环节
• 2.1.4 冷冻剂型
• 2.1.5 检测方法
• 2.2 繁殖新技术
• 2.2.1 精子性别控制技术
• 2.2.2 子宫深部输精技术
• 2.3 本试验研究的目的和意义
• 第二章 猪精液5ML大管冷冻保存的冷冻保护剂筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 主要药品及试剂
• 1.1.3 主要仪器设备及耗材
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 精液的采集
• 1.2.2 精液的稀释与平衡
• 1.2.3 冷冻精液制作
• 1.2.4 精液解冻
• 1.2.5 精子指标测定
• 1.2.6 数据处理
• 2 结果
• 2.1 不同浓度N-AcGA对猪5mL大管冷冻效果比较
• 2.2 不同浓度甘油对猪5mL大管冷冻影响效果比较
• 2.3 不同浓度卵黄对猪5mL大管冷冻影响效果比较
• 2.4 不同甘油平衡时间对猪5mL大管冷冻影响效果比较
• 2.5 卵黄、甘油、OEP和平衡时间之间的不同配伍对猪5mL大管冷冻影响效果比较
• 2.6 不同浓度谷胱甘肽对猪5mL大管冷冻影响效果比较
• 3 讨论
• 3.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖对解冻精子活力和项体形态的影响
• 3.2 甘油对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响
• 3.3 卵黄对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响
• 3.4 甘油平衡时间对解冻精子活力、质膜完整性和项体形态的影响
• 3.5 卵黄、甘油、OEP和平衡时间之间的配伍关系对冻后精子品质的影响
• 3.6 谷胱甘肽对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响
• 第三章 猪精液5ML大管冷冻和解冻方法的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 精液采集
• 1.2.2 精液冷冻
• 1.2.3 精液解冻
• 2 结果
• 2.1 不同冷冻高度猪5mL大管冷冻效果比较
• 2.2 解冻温度对精子活力和项体完整性的影响
• 3 讨论
• 3.1 冷冻高度对解冻精子活力、质膜完整性和顶体形态的影响
• 3.2 解冻温度对精子活力和顶体完整性的影响
• 第四章 颗粒、0.25ML细管和5ML大管三种剂型冷冻猪精液效果比较
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 主要仪器设备及耗材
• 1.2 方法
• 1.2.1 颗粒、0.25mL和5mL猪冻精的制作和解冻
• 1.2.2 体外受精
• 1.2.3 人工授精
• 1.2.4 统计与分析
• 2 结果
• 2.1 比较颗粒、0.25mL细管、5mL大管冷冻及各自冷冻温度曲线
• 2.2 冻精和新鲜精液受精能力的比较
• 3 讨论
• 第五章 猪精液5ML大管冷冻保存后超微结构观察
• 1 材料与方法
• 2 结果观察
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录