论文摘要
白细胞介素18（IL-18）具有广泛的生物学活性,能够促进γ-干扰素（IFN-γ）的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道。本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18（ChIL-18）的研究,先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统,在此基础上,对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测,对其在生产中的应用做了初步研究,同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。试验一不同复性方法对rChIL-18原核表达蛋白复性率和生物学活性的影响研究利用不同的复性方法辅助rChIL-18原核表达蛋白的复性,以提高鸡IL-18重组蛋白复性率,获得更多具有良好活性的蛋白。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性,然后利用盐酸胍-去离子水透析法、盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法和人工分子伴侣系统法分别辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后,利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性的方法获得的复性率最高,复性率为42.54﹪。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。由上述试验显示,人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性,获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。试验二人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白复性过程中影响因素的研究将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性。然后按照试验设计,考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明,利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性,为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了试验基础。试验三鸡IL-18原核表达蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究将鸡IL-18原核表达蛋白的复性产物和真核表达质粒pcDNA3.1TOPO-mChlL18分别与IBDV灭活疫苗联合应用,通过中和抗体检测和T淋巴细胞对ConA增殖反应试验,研究其对IBDV灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示,在接种后第21、28、35及42d时蛋白组和质粒组与单纯疫苗组抗体水平差异显著（P<0.05）,且蛋白组比质粒组效果更明显一些;其T淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组,尤其是在免疫14天后增殖效果明显高于单纯疫苗组（P<0.05）。接种42d后进行攻毒保护性试验,结果表明:同时接种鸡IL-18原核表达蛋白复性产物和真核表达质粒的试验组鸡获得93.3﹪的保护率,而单纯疫苗接种组的保护率为73.3﹪。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。结论人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性,获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。
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