鳖甲煎丸对肝癌细胞Wnt信号通路β-catenin及抑制因子FrpHE、DKK-1的影响

论文摘要

科研工作来源：广东省自然科学基金（9151051501000003）目的和意义：肝癌的发病机制复杂,是多因素、多基因、多途径共同参与的结果,其中细胞信号途径转导对其发生、发展起着至关重要的作用。近年来研究发现,肝癌的发生、发展与Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路有密切的关系,此通路的改变可能是肿瘤发生的共同途径。本研究以Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路为切入点,探讨鳖甲煎丸抗肝癌的分子机制,为鳖甲煎丸应用于临床提供理论依据,为开发抗肝癌的中药奠定坚实的理论基础。研究方法：培养人肝癌细胞（Hep3B.HepGZ）,并加入200ul高、中剂量鳖甲煎丸药物血清作用24h,以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子β-catenin的表达,以RT-PCR技术检测FrpHEmRNA和DKK- 1mRNA表达水平。研究内容和过程：1.药物血清的制备取200±l0g雄性Wistar鼠六只,随机分为正常组、鳖甲煎丸高、中剂量组（鳖甲煎丸高、中剂量组按2.2g.kg-1.d-1及1.1g.kg-1.d-1给药,连续给药3 d）。最后一次灌药（灌药前禁食不禁水12h）1h后,水合氯醛麻醉,腹主动脉采血,静置5min,以1000转／min的速度离心10min,各取上清lml至EP管中,再进行水浴灭活（56℃,30min）,后经微孔膜过滤后取得血清。2.细胞复苏与培养将装有人肝癌细胞（Hep3B、HepG2）的培养瓶分别放至40℃的水浴摇床中,以60转/分钟的速度慢摇至其溶解,后转入37℃的水浴箱中,手工慢摇恒温3min,再放到1000转/分钟的离心机中离心5分钟。离心结束后吸去上清加入DMEM+10%胎牛血清,混匀后放入培养箱内生长（37℃,5%C02）,于l0min后观察发现细胞贴壁情况良好。之后两种细胞均用10%胎牛血清的DMEM完全培养液进行培养,于37℃5%C02的培养箱内生长,细胞的传代速度达到了2代/周。3.流式细胞术检测鳖甲煎丸药物血清对肝癌细胞β-catenin表达的影响细胞加药24h后以胰酶消化成单细胞悬液,用PBS洗涤2遍之后以2%多聚甲醛固定30min,离心去上清后悬于PBS+0.1Triton-100+ 10%山羊血清的染色液中30 min,离心去上清后加入兔抗人β-catenin抗体后温室孵育60min,洗涤2次后加入羊抗兔IgG-FITC室温孵育30min后洗2遍,过400目尼龙网,上机检测。4.RT-PCR检测FrpHEmRNA和DKK-1mRNA水平分别收集经鳖甲煎丸药物血清作用24h的细胞,按TrizolReagent使用说明进行抽提总RNA。GAPDH引物序列：上游引物5’-CACAGTCCATGCCATCACTGC-3’,下游引物5’-GGTCT ACATGGCAACTGTG AG-3’ （609 bp）; FrpHE引物序列：上游引物5-CCGTGCTGCGCTTCTTCTTCTGTG-3’,下游引物5’-GCGGG ACTTG AGTTCGAGGG ATGG-3’（461 bp）; DKK-1引物序列：上游引物5’-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3’,下游引物5’-TGCATTTGGAT AGCTGGTTT AGT-3’（502 bp） （所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成）。按产品说明书操作,逆转录反应条件为50℃30min; PCR条件为：94℃2min热启动,94℃30sec变性,55℃30sec退火,72℃lmin延伸,反应40个循环。结果：鳖甲煎丸含药血清作用人肝癌细胞（Hep3B、HepG2）24 h后,β-catenin的表达水平明显下降,而FrpHEmRNA和DKK-1mRNA表达水平在人肝癌细胞较对照组表达水平显著增加。结论：经典Wnt/β-catenin信号通路是近年来肿瘤分子生物学领域研究的热点。转移是肝癌的基本特征之一,也是影响肝癌治疗效果的重要因素。研究发现,肝癌的转移与Wnt/β-catenin信号通路有一定的关系。β-连环素（β-catenin）是Wnt/β-catenin信号传导途径中关键调控因子,原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）标本中β-catenin表达程度与患者淋巴结转移及肝内转移呈正相关。β-catenin在该过程中具有双重作用：一方面,β-catenin在E-钙粘蛋白（E-cadherin）介导的粘附连接（adhering junction, AJ）或紧密连接复合物中通常处于结合状态,在钙粘蛋白和细胞骨架连接中起重要的桥梁作用,使E-钙粘蛋白保持粘附功能；另一方面,作为Wnt通路的关键效应分子,β-catenin的入核转运可促进肿瘤细胞转移相关基因的表达。因此,抑制β-catenin的表达有望成为抗肿瘤转移治疗的新靶点。sFRP （secreted Frizzled related protein）是一种分泌型糖蛋白,它可能与受体竞争结合wnt蛋白,或直接与Wnt蛋白结合,由此阻断了Wnt信号传导通路。有研究报道在胶质瘤细胞中,sFRP的表达伴随金属蛋白酶-2的活动,并且能够抑制Wnt通路的关键调节因子β-catenin的磷酸化作用,因此,sFRP能够抑制胶质瘤细胞的移动。本研究结果显示：加入鳖甲煎丸药物血清后人肝癌细胞（Hep3B、HepG2）β-catenin表达水平均较对照组明显降低,而抑制剂FrpHEmRNA和DKK-1mRNA表达水平与对照组相比表达水平明显升高。这说明鳖甲煎丸能通过β-catenin、FrpHE及DKK-1mRNA等作用靶点抑制Wnt信号通路,从而达到抗肿瘤转移的目的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 鳖甲煎丸对肝癌细胞Wnt信号通路β-catenin及抑制因子FrpHE、DKK-1的影响
• 第一节 Wnt/β-catenin信号通路在肝癌发生发展中的调控机制
• 一、wnt信号转导通路的组成
• 二、经典Wnt/β-catenin信号通路的转导过程
• 三、Wnt/β-catenin信号通路在肝癌发生发展的作用机制
• 参考文献
• 第二节 鳖甲煎丸治疗肝癌的临床与实验研究进展
• 一、肝癌的中医病证归属
• 二、鳖甲煎丸治疗肝癌的理论依据
• 三、鳖甲煎丸抗肝癌的实验研究
• 参考文献
• 第三节 鳖甲煎丸对肝癌细胞β-catenin及抑制因子FrpHE、DKK-1的影响
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 成果
• 致谢
• 统计学证明