论文题目: 细小病毒H-1感染对人肝癌细胞系QGY-7703基因表达影响的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物物理学
作者: 李健宏
导师: 罗祖玉
关键词: 细小病毒,非结构蛋白,基因表达,寡聚核苷酸芯片,实时反转录
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 细小病毒是一组无囊膜,线状,裂解性的DNA病毒,它们对转化细胞具有杀伤效应而对相应的非转化细胞则无害,是基因治疗的候选载体。因此揭示细小病毒-宿主相互作用的机制尤为重要。前人的研究已识别了不少在细小病毒生活史中必需的或有助于病毒增殖的细胞因子,也认识了病毒蛋白在宿主细胞中的部分作用。但细小病毒对宿主细胞分子的全面影响至今尚未被认识。 肝癌是中国和南亚地区最常见的疾病之一。几株肝癌细胞系和细小病毒H-1的相互关系已在以往的工作中进行过研究,其中肝癌细胞系QGY-7703是研究最为深入的一个。为了了解细小病毒感染后细胞在转录水平上的全面反应以及病毒可能的细胞靶因子,以QGY-7703-H-1作为一个模型系统,采用了能同时监测上千基因表达变化的基因芯片技术,以期识别和细小病毒-宿主相互作用机制有关的细胞靶因子基因及其可能参与的途径。 细小病毒的复制紧紧依赖于和增殖及分化有关的细胞因子,尤其是和细胞周期S-期有关的因子。反过来,病毒的增殖又使细胞周期停滞在S/G2期。为了提高细胞群中表达病毒基因组细胞的比例同时减少病毒对细胞周期的干扰使样品产生的差异,采用同步化的细胞进行实验。试验了血清饥饿法,异亮氨酸饥饿法,药物阻断法,以及异亮氨酸饥饿结合药物阻断等多种方法,发现草氨酸处理法既简便又能获得所需的高度同步化的细胞群。草氨酸处理使细胞周期被阻滞在G1末期,药物释放后细胞能同步化地经过一个周期。 细胞在该药物存在下被病毒感染。对感染后不同时间的同步化细胞的死亡率,病毒的复制情况进行了监测,结果表明在细胞周期阻滞释放后,NS1蛋白及其mRNA的量随时间的增加而增加,细胞死亡率在释放12小时之前很低但之后也随时间而增加。细胞仍同步地处于同一细胞周期阶段,NS1表达较高,而细胞死亡率仍较低的两个时间点(释放后6小时和12小时)被选择进行芯片实验。 用代表22,000个人类基因的寡聚核苷酸芯片(Genechip Human Genome U133A,Aflymetrix)对这两个时间点的基因表达谱进行了研究。为了保证实验结果的可靠性,对实验样品的质量主要是实验不同阶段RNA的完整性进行了多步骤的监测,表明各个步骤样品均具有很高的质量。芯片实验的重复次数为两次,两次独立而重复芯片实验在6小时时间点的相关系数(coefficient correlation)分别为0.994(病毒感染1vs病毒感染2)和0.994(对照1vs对照2),在12小时时间点的相关系数分别为0.980(病毒感染1vs病毒感染2)和0.975(对照1vs对照2),
论文目录:
一 中文摘要(Abstract in Chinese)
二 英文摘要(Abstract in English)
三 法文摘要(Abstract in French)
四 缩写(Abbreviation)
五 前言(Introduction)
六 正文
第一部分 非结构蛋白NSl在同步化QGY-7703细胞中的表达及其对细胞的影响(Part Ⅰ The expression of Nonstructure protein NS1 in synchronized QGY-7703 cell and its effect on the cell)
(一) 材料与方法(Material and methods)
1.细胞及其同步化
2.流式细胞仪分析
3.病毒制备、纯化与滴度分析
4.同步化细胞的感染
5.免疫荧光分析
6.Western杂交分析
7.台盼兰染色
8.Southern杂交分析
(二) 结果(Results)
1.支原体检测
2.QGY-7703细胞的同步化
3.H-1感染对QGY-7703细胞周期的干扰
4.NSl蛋白在同步化QGY-7703细胞中的表达，细胞死亡率及其形态变化
5.细小病毒H—1在同步化QGY-7703细胞中的复制
(三) 讨论(Discussion)
第二部分 细小病毒感染对QGY-7703细胞基因表达的影响(Part 36 Ⅱ The influence of parvovirus H-1 infection on the gene expression of QGY-7703 cell line)
(一) 材料与方法(Material and methods)
1.芯片杂交样品的制备
2.DNA芯片杂交和染色
3.扫描和结果分析
4.定量实时RT-PCR
5.传统PCR
6.数据处理
(二) 结果(Results)
1.芯片实验的质量控制
2.H-1感染后QGY-7703细胞基因表达谱的改变及其特点
3.定量实时反转录PCR对DNA芯片结果的验证
4.七个基因在H-1感染后转录水平的时间过程分析
5.从定量RT—PCR得到的其它结果
(三) 讨论(Discussion)
1.结果对进一步研究的启示
2.本实验研究中应用芯片技术的一些特点
七 综述(Review)
八 参考文献(References)
九 附录(Appendix)候选基因的功能及其它信息
十 详细英文摘要(Extended abstract in English)
十一 致谢(Acknowledgment)
论文独创性声明
论文使用授权声明
发布时间: 2005-09-19
参考文献
- [1].细胞粘附调节基因CARmRNA在肝癌细胞系中的表达及苦参碱体外诱导肝癌分化的实验研究[D]. 王涌.浙江大学2004
- [2].人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究[D]. 崔杰峰.复旦大学2004
- [3].重楼总皂苷作用人肝癌细胞系HepG2的蛋白质组学研究[D]. 程志祥.南京医科大学2008
- [4].RAGE在不同转移潜能人肝癌细胞系中的作用及其机制研究[D]. 易盼盼.中南大学2012
- [5].芝麻素对人肝癌细胞系HepG2的抑制作用及机理研究[D]. 邓鹏裔.华中科技大学2013
- [6].HMGB1在不同转移潜能人肝癌细胞系中的表达及潜在作用[D]. 陈若蝉.中南大学2012
- [7].microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究[D]. 彭晨星.河北医科大学2016
- [8].热休克蛋白70复合物抗人肝癌免疫的实验研究[D]. 王小平.第四军医大学2001
- [9].RAGE在人肝癌细胞系生物学行为变化中的作用[D]. 亚瑟.中南大学2012
- [10].人肝癌细胞系HepG2和正常人肝细胞系L02细胞周期糖蛋白糖谱的研究[D]. 王小强.西北大学2013
相关论文
- [1].人细小病毒B19-XA2株VP1蛋白Bac-to-Bac系统表达及免疫学特性分析[D]. 李小青.第四军医大学2008
- [2].鹅细小病毒和番鸭细小病毒部分基因组克隆、序列分析及VP2-VP3基因的表达[D]. 李雪梅.中国人民解放军军需大学2001
- [3].人细小病毒B19XA株VP1蛋白的表达、纯化和免疫原性研究[D]. 陈彩平.第四军医大学2004
- [4].猪细小病毒体外增殖的抑制因素、VP2基因变异及核酸疫苗的研究[D]. 魏战勇.南京农业大学2004
- [5].肿瘤坏死因子α诱导的cIAP2蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究[D]. 刘晓颖.复旦大学2005
- [6].重组猪瘟病毒T细胞表位的猪细小病毒样颗粒亚单位疫苗研究[D]. 范京惠.东北农业大学2005
- [7].伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的构建及检测技术研究[D]. 张焕容.四川农业大学2005
- [8].猪细小病毒非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2的研究[D]. 卿柳庭.华中农业大学2005
- [9].新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因抗肿瘤作用及其信号传导机制[D]. 连海.吉林大学2006
- [10].鹅细小病毒结构蛋白基因遗传进化分析及其基因免疫研究[D]. 赵丽荣.东北农业大学2006