甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育基因ms3的精细定位

论文摘要

9012AB是甘蓝型油菜隐性细胞核不育材料中的一种,其具有败育彻底、不育性稳定、恢复源广泛及无不良胞质效应等特点。遗传分析研究表明,该不育材料的育性受两对隐性重叠不育基因(ms3ms3、ms4ms4)和一对隐性上位抑制基因(rfrf)互作控制;两对不育基因隐性纯合时可导致雄性不育,而上位抑制基因隐性纯合时则可抑制不育基因的表达,使育性恢复正常(陈凤祥等,1998)。依照此遗传模式,9012AB不育系可以实现三系配套,从而解决核不育制种时需拔除50%可育株的问题。因此,近年来该系统引起了研究者的广泛关注;目前,利用该系统的育种工作已取得突破,对其不育控制机理的初步研究也已展开。以9012AB为主要研究材料,柯丽萍(2005)已将其中一个不育基因(ms3)初步定位在0.5cM的遗传区间。以此为基础,本研究进一步开展了隐性核不育基因ms3的精细定位研究,取得的主要结果和结论如下:1.以9012AB近等基因系为材料,应用重组单株BSA法,结合AFLP技术,继续筛选了2048对引物组合,获得了21个与目标基因更为紧密连锁的AFLP分子标记。其中有2个标记(AH15、AH17)在所用群体中与目标基因共分离,14个标记(AH1、AH2、AH3、AH4、AH6、AH8、AH9、AH10,AH11、AH13,AH18、AH19,AH20、AH21)位于目标基因的一侧,5个标记(AH5、AH7、AH12、AH14、AH16)位于目标基因的另一侧。两侧最近分子标记在1506株的近等基因系群体中将ms3基因限定在0.14cM的遗传区间.2.将AFLP标记AH2、AH6、AH15、AH9、AH16和AH22、AH23(王贵春博士提供)成功转化为稳定的SCAR标记(依次命名为SW0、SW1、SW2、SW3、SW4、SW5、SW6)。分别利用6,407、4,768和8,041个单株的9012AB分离群进一步分析上述SCAR标记与ms3基因的连锁关系。结果显示SCAR标记SW2、SW5、SW6依然与目标基因共分离,两侧最近标记SW1和SW4与目标基因间的遗传距离均为0.029cM,ms3基因被界定在0.058cM的遗传区段,实现了目标基因的精细遗传定位。3.Blastn分析表明:标记AH2、AH6、AH9、AHl5、AH16、AH22、AH23序列及其侧翼序列与拟南芥第5染色体上的部分序列具有较高的同源性,且标记在甘蓝型油菜基因组中的排列顺序与其同源区在拟南芥基因组中的排列顺序基本一致,覆盖拟南芥同源区约576kb的物理距离。据此推断,甘蓝型油菜中ms3基因所在区段在拟南芥基因组中存在一个共线性较好的区域。4.根据拟南芥同源区中已定位的油菜、甘蓝和白菜的ESTs、GSSs序列及拟南芥的基因组序列,设计引物开发出了6个与ms3基因紧密连锁的ACGM标记(AR23、AR44、AR45、AR48、AR52、AR53)。群体验证及重组单株分析发现.AR23与SW4同侧且与其共分离,另外5个ACGM标记与SW1同侧且与目标位点均有唯一的交换单株;至此,目标基因被进一步缩小至0.034cM的遗传范围内。5.以目标基因两侧标记AH9、AH16的侧翼序列,及共分离标记AH15的SCAR标记SW2和AH17的侧翼序列为探针,筛选Tapidor BAC文库,得到86个具有强杂交信号的BAC克隆。PCR分析从中鉴定出14个阳性克隆,但它们之间并不能形成一个完整的跨叠克隆群。6.以上述阳性克隆中BAC克隆o的质粒酶切产物为探针,再次筛选TapidorBAC文库,得到48个阳性克隆。PCR检测表明与BAC克隆o可能存在物理重叠关系的克隆为7个,且它们与上述14个克隆可以形成覆盖ms3区段的完整克隆重叠群。7.对21个阳性BAC质粒的Southern杂交分析进一步证明了克隆之间的相互重叠关系。结合PCR分析的结果,发现ms3区间至少可由6个BAC克隆构成一个完整的重叠群。利用亚克隆方法构建了一个可能含有目标基因的BAC克隆的测序文库,经测序已经获得了该克隆约150kb的序列。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 油菜隐性细胞核雄性不育的研究
• 1.1.1 隐性细胞核雄性不育的应用研究
• 1.1.2 隐性细胞核雄性不育基因的定位
• 1.1.3 隐性细胞核雄性不育的机理研究
• 1.1.3.1 隐性细胞核雄性不育的细胞学研究
• 1.1.3.2 隐性细胞核雄性不育的分子机理研究
• 1.2 质量性状精细定位的分子标记
• 1.2.1 特异引物PCR标记的来源途径
• 1.2.1.1 分子标记开发的直接途径
• 1.2.1.2 分子标记开发的间接途径
• 1.2.2 特异引物PCR标记的类型
• 1.2.2.1 SCAR标记
• 1.2.2.2 SSR标记
• 1.2.2.3 STS标记
• 1.2.2.4 一种新型的分子标记——扩增共有序列遗传标记
• 1.3 植物基因分离中的图位克隆技术
• 1.3.1 图位克隆的原理与技术环节
• 1.3.2 图位克隆中的关键点及应对措施
• 1.3.3 图位克隆技术的新发展和新策略
• 1.3.4 大基因组植物应用图位克隆策略的局限性
• 1.3.5 大基因组植物中的图位克隆策略
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 BSA与AFLP分析
• 3.2.1 样品采集及DNA提取
• 3.2.2 单株育性调查
• 3.2.3 DNA混合池的构建
• 3.2.4 AFLP分析
• 3.3 AFLP标记的克隆、测序及分析
• 3.3.1 差异片段的回收
• 3.3.2 连接反应
• 3.3.3 感受态细胞的制备及转化
• 3.3.4 重组子的筛选、鉴定
• 3.3.5 测序序列分析及比对
• 3.4 AFLP标记的SCAR转化
• 3.4.1 直接转化法
• 3.4.2 间接转化法
• 3.4.2.1 PCR-walking分离侧翼序列
• 3.4.2.2 比较测序
• 3.5 ms3基因的精细定位及遗传图谱的绘制
• 3.6 ms3位点连锁标记与拟南芥基因组序列的相似性分析
• 3.7 ACGM标记的开发
• 3.8 BAC文库的筛选
• 3.8.1 探针制备
• 3.8.2 Southern杂交
• 3.8.3 杂交信号的读取
• 3.8.4 BAC克隆的阳性验证
• 3.9 BAC克隆间重叠关系的确定
• 3.9.1 BAC克隆质粒的抽提
• 3.9.2 质粒的酶切、转膜、探针制备及Southern杂交
• 3.9.3 BAC克隆重叠群的构建
• 3.10 BAC克隆的测序
• 3.10.1 BAC克隆亚克隆文库的构建
• 3.10.2 亚克隆片段的测序
• 4 结果与分析
• 4.1 定位群体单株的育性调查
• 4.2 AFLP标记的筛选
• 4.3 AFLP标记差异片段的回收、测序和SCAR转化
• 4.3.1 直接源于AFLP序列的SCAR标记
• 4.3.2 依据AFLP标记侧翼序列的SCAR标记
• 4.3.2.1 标记侧翼序列的PCR-Walking分离
• 4.3.2.2 依据侧翼序列的SCAR标记转化
• 4.3.3 基于比较测序的SCAR标记
• 4.4 目标位点连锁标记与拟南芥序列的同源性BLAST
• 4.5 ms3基因的精细遗传定位
• 4.6 目标基因区域遗传距离的进一步缩小
• 4.6.1 基于序列同源性比较的ACGM标记的开发
• 4.6.2 ACGM标记在交换单株中的分析
• 4.7 Tapiaor BAC文库的筛选及BAC克隆的阳性验证
• 4.8 含有ms3基因的BAC重叠群的确定
• 4.9 BAC克隆O的亚克隆文库的构建、测序
• 5 讨论
• 5.1 与目标基因连锁更紧密标记的筛选
• 5.2 SCAR标记的转化
• 5.3 基于共线性比较的ACGM标记的开发
• 5.4 ms3基因定位结果的比较分析
• 5.5 研究中物理距离与遗传距离的对应关系问题
• 5.6 进一步精细定位ms3基因的设想
• 参考文献
• 附录:部分实验的详细操作步骤
• 致谢