论文摘要
一、研究背景脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor, BDNF）,是神经营养因子家族的重要成员之一。它可以促进中枢神经系统神经元的发育、生长、存活和分化。此外,很多证据表明BDNF在神经元的可塑性及长时程增强等方面发挥着重要作用。近来对于BDNF基因上SNP位点rs6252的研究与日俱增。该突变可导致编码BDNF蛋白基因第66位密码子由缬氨酸（Val）突变为甲硫氨酸（Met）,进而导致BDNF转运障碍和调节性BDNF分泌降低。人群中,携带有Met的杂合子表现为海马容积的减少和海马依赖的学习记忆功能受损,并且与多种神经精神疾病的发生密切相关。有研究表明BDNF不仅存在于神经系统,也存在于其他多种器官中。近期有研究证明BDNF及其受体TrkB同样出现在卵巢、子宫等女性生殖器官中。使用体外培养卵细胞及转基因小鼠研究发现BDNF对卵细胞的成熟及受精卵的发育有重要作用。对子宫内膜异位所致不孕患者的临床研究也进一步发现,其卵泡液内BDNF的含量明显降低,提示BDNF可能参与女性生殖功能的调控。那么BDNFMet基因变异后是否会增加女性患不孕的风险,其可能的机制又是什么?这成为本实验关注的重点。为此,本实验收集280例子宫内膜异位症不孕患者,130例单纯输卵管因素所致不孕患者和114例正常怀孕女性为对照,探讨BDNFMet基因多态性对女性生育能力的影响。此外本研究还利用实验室早前构建的BDNFMet knock in小鼠BDNFMet转基因小鼠模型,研究BDNFMet基因多态性对生殖能力的影响及机制。二、研究目的1.观察BDNFVal66Met基因多态性与子宫内膜异位所致女性不孕的相关性,及对该类患者IVF治疗效果的影响和可能的机制。2.观察BDNF Val66Met基因变异雌性小鼠生育能力的改变,并探索其机制。三、实验方法1.BDNF Val66Met基因变异在子宫内膜异位症不孕中的作用1.1人外周血DNA的提取,Real-time PCR基因型鉴定1.2临床子宫内膜异位患者IVF-ET分析1.3ELISA检测人血浆和卵泡液中BDNF蛋白含量2. BDNF Val66Met基因变异降低雌性生殖能力的机制研究2.1交配实验观察BDNFMet/Met基因型小鼠的生殖能力2.2小鼠动情周期的检测2.3通过石蜡包埋、切片观察小鼠卵巢中各种卵泡数及子宫内膜是否产生病理性变化2.4卵巢、子宫HE染色2.5ELISA测下丘脑和垂体、卵巢、子宫的BDNF蛋白浓度2.6促排卵试验观察小鼠对激素的反应能力四、实验结果1BDNF Val66Met基因变异在子宫内膜异位症不孕中的作用1.1BDNFVal66Met变异增加子宫内膜异位症女性不孕的发生对正常生育女性、输卵管因素不孕女性及子宫内膜异位症不孕女性行BDNFMet基因型鉴定,发现子宫内膜异位症不孕女性BDNFMet/Met基因型（32.5%）和Met等位基因频率（57.1%）分别较其它两组明显增高（P=0.043,P=0.015）,提示BDNF Val66Met变异可能是导致子宫内膜异位症女性不孕的危险因素之一。1.2BDNF Val66Met变异降低不孕患者IVF治疗效果所收集的子宫内膜异位症不孕患者和输卵管因素不孕患者中分别有198名和102名行IVF-ET台疗,我们将其按BDNFMet基因型分别分为三组。在子宫内膜异位症不孕患者中,携带BDNFMet/Met的患者较BDNFVal/Val携带者使用了更高剂量的Gn（P<0.01）,但却获得更少的成熟卵（P<0.01）、更低的受精率（P<0.05）和更少的高质量胚胎（P<0.05）。此外,输卵管因素不孕患者中也发现了类似的现象：在输卵管阻塞病相关不孕的病人中BDNFMet/Met基因型的人群相比于BDNFVal/Val基因型人群,这些指标也呈现相似的差异：在更高剂量的Gn（P<0.01）下有更少的成熟卵（P<0.05）和更低的受精率（P<0.01）。1.3BDNF Val66Met变异降低IVF患者卵泡液中BDNF含量在对上述行IVF治疗的病人取卵时,分别抽取静脉血和卵泡液,用ELISA方法检测BDNF蛋白的含量。结果发现,不论是子宫内膜异位症不孕患者还是输卵管因素不孕患者,BDNFMet/Met携带者较BDNFVal/Val携带者卵泡液中BDNF蛋白水平明显下降（P<0.05）,而血浆中BDNF含量不受影响。2BDNF Val66Met基因变异降低雌性生殖能力的机制2.1BDNFMet/Met基因型小鼠相对于野生型小鼠的生殖能力减弱。选取10周龄不同BDNF基因型的雌性小鼠分别与野生型雄鼠交配,结果显示BDNFMet/Met基因变异雌性小鼠的生育率较BDNFVal/Val雌鼠明显降低（P<0.05）,每胎产仔数也略有降低但没有统计学差异,提示BDNFMet/Met变异会影响雌性小鼠的生殖能力。2.2BDNFMet/Met基因型小鼠的动情周期变化。分别取10周和28周大的BDNFVal/Val、BDNFMet/Met雌鼠测量动情周期。发现10周时两组小鼠都呈现正常的动情周期,但28周时,BDNFMet/Met小鼠动情周期呈现出不规律性,具体表现在动情间期时间较BDNFVal/Val明显延长（P<0.05）,动情期持续时间显著减少（P<0.01）2.3BDNFMet/Met基因变异影响卵泡成熟。分别取3周、10周的BDNFMet/Met和BDNFVal/Val小鼠卵巢,经石蜡切片和HE染色等步骤,统计卵巢中各级卵泡数目。结果发现：3周龄BDNFMet/Met雌鼠的窦前卵泡（PF）、窦状卵泡（A）、闭锁卵泡数（AF）与野生型小鼠相比无统计学差异；而10周龄BDNFMet/Met基因型小鼠的黄体、窦状卵泡数目减少（P<0.05）,与此同时,闭锁卵泡数目却显著增加（P<0.05）。这提示BDNFMet/Met变异小鼠生殖能力的减弱并不是由于原始卵泡的数量受到影响,而是由于卵泡从窦前卵泡发育为成熟卵泡的过程受到了影响。2.4BDNF蛋白在下丘脑垂体、卵巢中的含量减少,而子宫内的含量不变。分别取10周BDNFMet/Met和BDNFVal/Val小鼠下丘脑、卵巢和子宫,利用ELISA试剂盒,测组织中BDNF蛋白水平。与BDNFVal/Val小鼠相比,BDNFMet/Met变异可导致下丘脑和卵巢中BDNF的含量显著减少（P<0.05）。但在子宫内BDNF蛋白水平无明显改变（P<0.05）。2.5BDNFMet基因变异降低小鼠对促排卵药物的反应我们通过对3周的不同基因型小鼠腹腔注射PMSG（促进卵泡生长的一种性激素）,48h后腹腔注射hCG（促进排卵的一种性激素）,16h后处死小鼠并从壶腹部取卵,镜下数出排卵个数。我们发现,BDNFMet/Met基因型小鼠对激素的反应能力下降（P<0.05）。五、实验结论1、 BDNF Val66Met基因变异与子宫内膜异位症女性不孕的发生密切相关,并且该变异还能导致患者对IVF治疗的反应性明显降低,这可能和卵泡液中BDNF的含量降低有关。2、BDNFMet/Met基因型雌鼠呈现出低生育能力的表型。该表型的发生与BDNFMet/Met小鼠卵巢中卵泡的发育不良有关,同时下丘脑及卵巢中BDNF含量的降低也可能会通过影响性激素的分泌造成不孕的发生。BDNFMet/Met小鼠对促排卵药物的反应性明显降低,这与人类临床表型是相似的。
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- [2].BDNF Val66Met多态性与长寿群体代谢综合征危险因素的相关性研究[J]. 临床检验杂志 2014(10)
- [3].BDNF Val66Met基因多态性与老年糖尿病患者认知功能损害的相关性[J]. 疑难病杂志 2020(03)
- [4].抑郁症患者BDNF Val66Met基因多态性与抗抑郁药疗效的Meta分析[J]. 牡丹江医学院学报 2018(03)
- [5].BDNF基因多态性与老年抑郁症及认知功能的关联研究[J]. 现代医学 2015(11)
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