稻瘟病菌Rho族GTP酶功能分析

论文摘要

Rho族蛋白是Ras超家族最主要成员之一，已发现的有Rho、Rac、Cdc42三个亚家族近百种蛋白。大量研究结果表明，Rho族蛋白在调控与肌动蛋白骨架相关的信号转导途径，并参与MAP激酶的细胞信号转导过程，起着调节细胞极性、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡、基因转录、细胞周期、微管活力、细胞转化、囊状运输途径、从吞噬细胞的NADPH氧化酶至酵母中葡聚糖合成酶等一系列酶活性、恶性肿瘤细胞的浸润和转移等重要作用。在真菌中，几乎所有Rho族蛋白都被证实参与调控细胞极性生长，其还参与调控细胞壁合成及其完整性、胞外分泌、细胞分化等；在丝状真菌中其还参与调控侵染致病过程。 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)是研究丝状真菌的重要模式生物，也是引起水稻重要病害稻瘟病的病原菌。该菌侵染循环过程经历了分生孢子萌发、附着胞分化、侵入栓的形成以及侵染生长，这一过程涉及复杂的细胞分化、信号转导和极性生长。 数据库分析结果表明，稻瘟病菌基因组中有7个Rho族蛋白成员，且通过基因表达分析表明这7个Rho族蛋白在稻瘟病菌中均可表达，因而我们推测这些Rho族蛋白在稻瘟病菌生长发育以及侵染致病过程中可能起着极为关键的作用。本论文选择了具有代表性的两个Rho族蛋白成员(MgCdc42和MgRho3)，深入开展了功能分析。 MgrCdc42在稻瘟病菌分生孢子中表达最强，通过构建插入失活突变体、持续激活突变体、负显性失活突变体以及过量表达突变体，分析了MgCdc42在稻瘟病菌中的功能。研究结果表明，MgCdc42插入失活突变导致稻瘟病菌侵入栓形成受抑，从而引起致病性显著下降；产孢量减少，分生孢子形态异常，气生菌丝生长受抑，菌丝异常；在疏水性表面分生孢子萌发延迟，附着胞形成滞后、减少，且附着胞异常。而MgCdc42负显性突变的结果与MgCdc42插入失活突变结果十分相似，最终也导致了稻瘟病菌分生孢子、营养菌丝异常，附着胞形成受抑，并导致了侵染能力下降。MgCdc42持续激活突变体之分生孢子正常，但其菌丝末端分枝增多，附着胞形成减少且侵染能力也大为下降。与这些突变体不同的是，MgCdc42过量表达突变体与稻瘟病菌野生型菌株之表型及侵染致病能力差异不显著。这些结果表明MgCdc42调控着稻瘟病菌细胞分化、极性生长以及其侵染致病过程。 MgRho3在稻瘟病菌分生孢子萌发阶段表达最强，通过构建插入失活突变体以及过量表达突变体，其在稻瘟病菌中的功能也得以解析。研究结果表明，MgRho3插入失活突变体侵染致病能力也显著下降，但与MgCdc42插入失活导致稻瘟病菌侵入栓形成受抑，并引起致病性显著下降不同的是，似乎MgRho3插入失活导致稻瘟病菌附着胞形成严重受抑，而引起侵染力下降。MgRho3插入失活还促使稻瘟病菌分生孢子从倒梨形改变为长椭圆形，产孢量减少；分生孢子萌发延迟，附着胞形成滞后且降低；菌丝末端分枝增多。与MgCdc42过量表达突变体不同的是，MgRho3过量表达突变体侵染能力提高，其可能是MgRho3过量表达突变体分生孢子可产生双附着胞引起的。MgRho3过量表达

论文目录

• 独创性声明
• 论文使用授权的说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 Ras超家族蛋白
• 1.2 Rho家族蛋白
• 1.2.1 哺乳动物Rho族蛋白
• 1.2.2 植物Rho族蛋白
• 1.2.3 真菌中的Rho蛋白
• 1.3 稻瘟病菌生长发育及侵染致病的信号途径
• 2 稻瘟病菌Rho族蛋白分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 蛋白序列获得、分析及系统深化关系分析
• 2.1.1.1 蛋白序列同源性搜索比较及其系统演化关系分析
• 2.1.1.2 蛋白结构域的分析
• 2.1.2 稻瘟病菌Rho族蛋白的表达
• 2.1.2.1 菌株材料
• 2.1.2.2 稻瘟菌菌丝体、孢子、芽管以及附着胞获得
• 2.1.2.3 总RNA提取及检测
• 2.1.2.4 引物
• 2.1.2.5 反转录
• 2.1.2.6 PCR
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 稻瘟菌基因组Rho族蛋白编码基因分析
• 2.2.2 真菌Rho族蛋白的系统演化关系
• 2.2.3 Rho族蛋白在稻瘟菌不同生长发育阶段的表达分析
• 2.2.4 稻瘟病菌中Rho蛋白关系初探
• 2.3 讨论
• 3 稻瘟病菌MgCdc42功能分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 3.1.4 Southern杂交
• 3.1.4.1 DNA转印
• 3.1.4.2 探针的扩增
• 3.1.4.3 探针的标记
• 3.1.4.4 杂交及检测
• 3.1.5 稻瘟菌菌丝体、孢子、芽管、附着胞获得及total RNA的提取
• 3.1.6 Nothern杂交
• 3.1.6.1 RNA凝胶电泳
• 3.1.6.2 RNA转印及固定
• 3.1.6.3 杂交探针的准备
• 3.1.6.4 探针的标记
• 3.1.6.5 杂交与检测
• 3.1.7 MgCdc42突变体的构建
• 3.1.7.1 Cdc42打断质粒p113-hph的构建
• 3.1.7.2 MgCdc42互补载体的构建
• 3.1.7.3 MgCdc42显性突变体的载体构建
• 3.1.7.4 MgCdc42过量表达突变体的载体构建
• 3.1.8 稻瘟病菌原生质体制备和转化
• 3.1.9 细胞形态观察
• 3.1.10 孢子萌发及附着胞形成实验
• 3.1.11 洋葱表皮内侵染结构的观察
• 3.1.12 大麦接种实验
• 3.1.13 致病性鉴定
• 3.1.14 稻叶组织侵染实验
• 3.1.15 引物
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 稻瘟病菌Cdc42蛋白序列分析
• 3.2.2 Cdc42在稻瘟病菌中是单挎贝基因,在分生孢子中表达量最高,且可能有两种剪切方式
• 3.2.3 MgCdc42插入失活突变体的筛选
• 3.2.4 MgCdc42插入失活导致稻瘟病菌致病性丧失
• 3.2.5 无法产生侵入栓是稻瘟病菌MgCdc42插入失活突变体致病性丧失
• 3.2.6 稻瘟病菌插入失活突变体导致附着胞形成受抑
• 3.2.7 MgCdc42失活影响了稻瘟病菌的营养生长、产孢,且丧失了交配能力
• 3.2.8 稻瘟病菌MgCdc42 Ectopic菌株生长发育及致病性情况
• 3.2.9 转化野生型MgrCdc42至△Mgcdc42-1,恢复了zJMgcdc42-1的正常生长发育及致病性
• 3.2.10 MgCdc42显性突变影响了稻瘟病菌的生长发育及致病性
• 3.2.11 MgCdc42过量表达对稻瘟病菌生长发育及侵染致病无显著影响
• 3.3 小结与讨论
• 4 稻瘟病菌MgRho3功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 4.1.4 Southern杂交
• 4.1.4.1 DNA转印
• 4.1.4.2 探针的扩增
• 4.1.4.3 探针的标记
• 4.1.4.4 杂交及检测
• 4.1.5 稻瘟菌菌丝体、孢子、芽管、附着胞获得,total RNA的提取以及RT-PCR
• 4.1.6 MgRho3突变体的构建
• 4.1.6.1 MgRho3插入失活突变体载体的构建
• 4.1.6.2 MgrRho3互补载体的构建
• 4.1.6.3 MgRho3过量表达突变体的载体构建
• 4.1.7 稻瘟病菌原生质体制备和转化
• 4.1.8 细胞形态观察
• 4.1.9 孢子萌发及附着胞形成实验
• 4.1.10 洋葱表皮内侵染结构的观察
• 4.1.11 大麦接种实验
• 4.1.12 致病性鉴定
• 4.1.13 引物
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 稻瘟病菌MgRho3基因克隆
• 4.2.2 MgRho3在稻瘟病菌不同阶段的表达动态
• 4.2.3 MgRho3插入失活突变体以及过量表达突变体的筛选
• 4.2.4 MgRho3插入失活导致了稻瘟病菌致病能力下降,而过量表达MgRho3导致稻瘟病菌致病性显著提高
• 4.2.5 MgRho3插入失活导致稻瘟病菌附着胞形成受抑,而过量表达导致其产生具侵入能力的双附着胞
• 4.2.6 稻瘟病菌MgRho3插入失活导致了分生孢子萌发延迟、附着胞形成滞后并减少；与之相反,MgRho3过量表达突变体附着胞形成提早
• 4.2.7 MgRho3插入失活导致了稻瘟病菌菌丝生长、产孢异常
• 4.2.8 MgRho3互补菌株的筛选及其观察
• 4.3 小结与讨论
• 5 稻瘟病菌MgRho3与MgCdc42关系初探
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 5.1.4 稻瘟菌菌丝体total RNA的提取以及RT-PCR
• 5.1.5 MgRho3/MgCdc42双突变体筛选
• 5.1.5.1 MgrRho3插入失活突变体中过量表达MgCdc42
• 5.1.5.2 MgCdc42插入失活突变体中过量表达MgRho3
• 5.1.6 细胞形态观察
• 5.1.7 孢子萌发及附着胞形成实验
• 5.1.8 洋葱表皮内侵染结构的观察
• 5.1.9 致病性鉴定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 MgCdc42与MgRho3表达关系初探
• 5.2.2 MgRho3插入失活突变体中过量表达MgCdc42
• 5.2.3 MgCdc42插入失活突变体中过量表达MgRho3
• 5.3 小结与讨论
• 6 稻瘟病菌MgCdc42互作蛋白初探
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 蛋白序列同源性搜索
• 6.1.2 稻瘟菌Rho族蛋白编码基因的表达分析
• 6.1.3 蛋白互作分析
• 6.1.3.1 转化载体的构建
• 6.1.3.2 酵母转化
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 稻瘟菌Cdc42互作同源蛋白搜索
• 6.2.2 稻瘟菌MgCdc42互作蛋白表达分析
• 6.2.3 MgCdc42与Chm1互作分析
• 6.3 小结与讨论
• 7 总结
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢