UV诱导HLEC凋亡的细胞及分子机制的实验研究

论文摘要

目的用不同剂量紫外线（Ultraviolet, UV）照射体外培养人晶状体上皮细胞（Human lens epithelial cell, HLEC）通过对HLEC凋亡凋亡调控基因（Bax、Bcl-2）、细胞周期及ALDH,蛋白表达变化的观察,探讨紫外线诱导HLEC凋亡的细胞及分子生物学机制。方法本试验以实验室培养的HLEC细胞株为研究模型,采用同一紫外线光源（UVA照度为0.29mw/cm2,UVB照度为0.09 mw/cm2）,对HLEC进行照射。按UV照射时间将HLEC分为Omin、5min、10min、15min及30min组,UV照射后HLEC放回二氧化碳培养箱继续培养12小时后再进行各项检测。1.UV诱导HLEC凋亡的检测：采用Hoechst 33342染色、琼脂糖凝胶电泳对HLEC凋亡进行定性检测；AO-EB染色及Annexin-V +PI双染流式细胞计数对HLEC凋亡进行定量检测,并分析UV照射剂量与凋亡率间的关系。2.UV照射诱导HLEC凋亡基因的表达及细胞周期的变化：用原位杂交的方法检测各组Bax、Bcl-2 mRNA表达,流式细胞术检测细胞周期的变化。3.UV照射对HLEC内ALDH1蛋白表达的影响：用免疫组化的方法观察ALDH1在对照组及各实验组的表达,用Western Blot对其蛋白含量进行测定。结果1.UV照射与HLEC凋亡：Hoechst 33342染色及AO-EB染色UV处理后各实验组HLEC均有凋亡特征性形态改变,如细胞质浓缩,细胞核致密浓染或呈碎块状形成凋亡小体等。琼脂糖凝胶电泳法检测除5min组外其余各组都出现DNA ladder,上述三种方法定性证实UV可诱导HLEC凋亡。AO-EB染色法检测HLEC凋亡率在Omin、5min、l0min、15min、30min组分别为1.82±0.53%、13.15±2.32%、17.58±1.62%、31.16±3.03%、29.25±2.53%（F=146.10,P<0.05）。Annexin-V+PI双染流式细胞计数检测以上各组凋亡率分别为1.98±0.84%、11.90±3.21%、16.15±3.05%、33.93±3.74%、22.72±6.05%（F=34.16,P<0.05）。两种方法定性分析均表明随UV照射时间的延长凋亡率增加。2.UV照射与Bax上调和Bcl-2下调：随UV照射时间延长,Bcl-2阳性细胞率逐渐降低,而Bax阳性细胞率逐渐增加。经配对资料T检验,组与组间差异有显著性（P<0.05）。HLEC凋亡率与Bcl-2/Bax比率呈负相关（r=-0.874,P<0.05）。UV照射与HLEC细胞周期阻滞：各实验组G2/M期细胞与Omin组比较差异有显著性（P<0.05）,但各实验组间差别无显著性（P>0.05）；经单因素方差分析,S期细胞随UV照射时间延长逐渐减少（F=40.34,P<0.05）。3.UV照射与ALDH1:ALDH1免疫组化染色阳性细胞率在Omin、5min、10min、15min及30min组分别为39.23±5.34%、30.57±4.45%、17.91±4.28%、10.25±3.01%、3.83±0.83%,各组阳性细胞率的两两比较除Omin组与5min组间差异无显著性外（P>0.05）,其余各组间两两比较差异均有显著意义（P<0.05）；ALDH1免疫组化染色阳性细胞率随着UV照射时间延长而降低（F=68.827,P<0.05）；Western blot灰度比值随UV照射时间延长逐渐下降（F=17.256,P<0.05）。结论1.UV照射可诱导HLEC凋亡,凋亡率在一定时间内与UV照射剂量和时间呈正相关。2.UV照射可诱导HLEC凋亡调控基因Bax上调和Bcl-2下调。3.UV照射可诱导HLEC细胞周期阻滞,与剂量呈正相关。4.UV可导致HLEC内ALDH1含量下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文名词及缩略语表
• 前言
• 第一部分 UV诱导HLEC凋亡的检测
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二部分 UV照射诱导HLEC凋亡基因的表达及细胞周期的变化
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三部分 UV照射对HLEC内ALDH1蛋白表达的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果