胸腺素β4对外周血内皮祖细胞功能的影响及机制探讨

论文摘要

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一类血管内皮细胞的前体细胞,它可向血管内皮细胞分化,但尚未完全表达成熟血管内皮细胞表型。EPCs兼具造血干细胞及内皮细胞的部分表面标志,如CD34、CD133、VEGFR-2等。大量研究表明,EPCs在缺血组织的血管新生、损伤血管的再内皮化、内皮功能障碍的逆转等方面扮演重要角色,因而在心血管系统的修复中发挥重要作用。然而,多种冠心病危险因素诸如老龄、吸烟、高血压、高胆固醇血症、糖尿病等会使循环EPCs的功能受损,从而限制了基于EPCs的细胞治疗手段在临床中的应用。因此,探求有效途径增强EPCs功能至关重要。胸腺素（thymosins）是一类多肽分子,最初从小牛胸腺中提取得到,根据其等电点的不同而分为三个亚家族（α,β和γ亚家族）。胸腺素β4（thymosinβ4,Tβ4）是胸腺素β家族中的一员,由43个氨基酸残基组成,广泛分布于人体内多种组织与细胞中。Tβ4介导了多种生物学反应,如血管新生、创伤愈合等。此前研究表明,Tβ4能增强多种干/祖细胞的增殖、迁移、分化等功能,进而促进血管新生及心肌修复。但是,目前尚未明确Tβ4是否可通过增强循环EPCs的功能而发挥心血管保护作用。基于上述理论基础,我们提出假设:Tβ4能增强EPCs的功能,促进其修复血管内皮,维持内皮的完整性,从而发挥心血管保护作用。由于目前对Tβ4影响EPCs的功能及其机制方面知之甚少,我们首先观察了Tβ4对EPCs增殖、迁移、粘附等功能的影响,并探讨了可能参与其中的信号转导途径,然后观察了Tβ4对EPCs凋亡及衰老的作用。以下分三部分对本研究的方法、结果及结论作一简述。1胸腺素β4对外周血内皮祖细胞功能的影响目的:观察Tβ4体外干预对外周血EPCs功能的影响方法:采用密度梯度离心法从人外周血获取单个核细胞,将其接种于人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,收集贴壁细胞,予FITC-UEA-I及DiI-acLDL染色,激光共聚焦显微镜下观察,双染色阳性细胞鉴定为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志（VEGFR-2,CD34,CD133）,进一步鉴定EPCs。加入不同浓度Tβ4（1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL和1000ng/mL）干预,并进行细胞功能学实验。分别采用MTT比色法、集落形成实验、Transwell迁移实验和粘附能力测定实验观察EPCs的增殖能力、集落形成能力、迁移能力和粘附能力。结果:Tβ4能明显增加EPCs的增殖、集落形成、迁移和粘附能力,并呈一定的量效关系,在1000ng/mL组达到最大效应（与对照组比较,增殖能力0.409±0.020 vs0.257±0.015,P<0.05;集落形成能力16.7±2.6 vs 6.0±1.0,P<0.05;迁移能力79.6±5.6 vs 31.5±3.4,P<0.05;粘附能力45.3±4.7 vs 18.8±3.0,P<0.05）。结论:Tβ4可增强EPCs的功能,且Tβ4对EPCs功能的影响呈一定的量效关系。2胸腺素β4影响外周血内皮祖细胞功能的信号转导机制探讨目的:观察Tβ4影响外周血内皮祖细胞功能的信号转导机制方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,收集贴壁细胞,予FITC-UEA-I及DiI-acLDL染色,激光共聚焦显微镜下观察,双染色阳性细胞鉴定为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志（VEGFR-2,CD34,CD133）,进一步鉴定EPCs。加入Tβ4干预,western blot检测EPCs Akt Ser473、eNOS Ser1177和ERK1/2的磷酸化水平。随后,在分别加入磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）抑制剂、内皮型-氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）抑制剂、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK）1/2抑制剂预处理EPCs30min后,再予1000ng/mLTβ4干预,采用MTT比色法、Transwell迁移实验和粘附能力测定实验分别观察EPCs的增殖能力、迁移能力和粘附能力。结果:Westernblot检测显示Tβ4能促进Akt ser473、eNOS Ser1177和ERK1/2的磷酸化,且均呈一定的时效和量效关系。PI3K抑制剂（LY294002,Wortmannin）及eNOS抑制剂（L-NAME）均显著抑制了Tβ4促进EPCs增殖、迁移和粘附的作用,而ERK1/2抑制剂（PD98059）则均无明显影响。结论:PI3K/Akt/eNOS而非ERK1/2信号转导途径参与对Tβ4促进EPCs增殖、迁移、粘附的调控。3胸腺素β4对外周血内皮祖细胞凋亡和衰老的影响目的:观察Tβ4对外周血内皮祖细胞凋亡和衰老的影响方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,收集贴壁细胞,予FITC-UEA-I及DiI-acLDL染色,激光共聚焦显微镜下观察,双染色阳性细胞鉴定为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志（VEGFR-2,CD34,CD133）,进一步鉴定EPCs。贴壁细胞培养7d后,采用去血清培养以诱导EPCs凋亡。在去血清培养EPCs 24h后加入不同浓度Tβ4（1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL和1000ng/mL）干预,继续培养24h,Alexa Fluor（?）488-Annexin V/PI流式细胞仪检测细胞凋亡。贴壁细胞培养4d后,加入不同浓度Tβ4（1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL）干预,继续培养7d后,采用SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老。结果:Tβ4能明显抑制EPCs的凋亡和衰老,且均呈一定的量效关系,在1000ng/mL组达到最大效应（与对照组比较,细胞凋亡率6.67±0.72% vs 16.58±1.56%,P<0.05;SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量19.3±2.6% vs 42.7±4.3%,P<0.05）。结论:Tβ4能明显抑制EPCs的凋亡和衰老,且Tβ4对EPCs凋亡和衰老的影响均呈一定的量效关系。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略词
• 目次
• 正文
• 前言
• 1 胸腺素β4对外周血内皮祖细胞功能的影响
• 引言
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 参考文献
• 2 胸腺素β4影响外周血内皮祖细胞功能的信号转导机制探讨
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 3 胸腺素β4对外周血内皮祖细胞凋亡和衰老的影响
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果