CVF和凉膈散对创伤失血性休克大鼠肝脏损害机制的研究

论文摘要

目的观察CVF和凉膈散在创伤失血性休克大鼠肝脏损害机制中的作用方法采用骨折后经颈动脉放血制备创伤失血性休克大鼠模型,20只Wistar雄性大鼠制作此模型,观察生命体征变化和肝脏损害；然后将130只Wistar雄性大鼠,随机分为假手术组、模型组1h、3h、6h、24h,蛇毒因子CVF+模型组1h、3h、6h、24h、凉膈散+模型组1h、3h、6h、24h共13组,每组10只大鼠。分别于相应时间点处死动物,收集下腔静脉血液、肝脏,部分肝脏用石蜡包埋制作病理切片。取肝脏,用免疫组化方法检测膜攻击复合物C5b-9在肝脏的沉积、bax、bcl-2、fas、fasL、Caspase-3、补体片段C5a受体C5a-R表达；用原位末端缺刻标记法（TUNEL）检测肝细胞凋亡。采用Western blot方法检验C5a-R、Caspase-3在肝脏的表达。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肝脏bax、bc12、fas、fasL基因的表达。取血浆,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中膜攻击复合物C5b-9、补体片段C5a、补体总活性CH50浓度,采用速率法测量天冬氨酸转氨酶（AST）的浓度。结果第一部分：建立创伤失血性休克大鼠模型,死亡率控制在20%,发现血浆天冬氨酸转氨酶AST上升,肝脏细胞出现水肿、坏死、炎性细胞浸润。第二部分：1.模型组：①补体系统变化：取血浆,模型组1h、3h、6h血浆补体总活性CH50较假手术显著上升,在1h达高峰值,3h开始下降,24h时较假手术组显著下降：在假手术组血中能检测到少量的C5b-9,模型1h、3h、6h较假手术组显著上升,1h达到高峰,24h下降与假手术组无显著性差异；补体片段C5a 3h、6h、24h较假手术组和1h组显著上升,24h达峰值；取肝脏,在假手术组及模型1h、6h肝脏未发现膜攻击复合物C5b-9的沉积,模型24h发现少量沉积,在模型3h时门管区大量肝脏实质细胞存在C5b-9沉积；肝脏C5a-R mRNA 1h、3h、6h、24h较假手术组显著上升,6h达峰值；C5a-R蛋白3h、6h、24h较假手术组和模型组1h显著上升,24h达到峰值；②凋亡变化：假手术组未检测到凋亡细胞,模型组1、6、24h发现散在凋亡,在模型3h中央静脉周围凋亡明显增加,出现凋亡高峰,与其余各组比较差异有统计学意义；bax mRNA、fas mRNA、Bax/Bcl-2蛋白比值和caspase3蛋白在3h达高峰；fasL在6h达高峰。③天冬氨酸转氨酶AST在模型1h、3h、6h、24h较假手术组显著上升（P均<0.05）,24h达峰值。病理评分模型组1h、3h、6h、24h较假手术组显著上升,24h达峰值。2.应用CVF组①补体系统变化：血浆CH50、血浆C5b-9在1h、3h、6h较模型组显著下降,在24h较模型组显著上升（P<0.05）；血浆C5a在1h较模型组显著上升,在3h、6h、24h与模型组均无显著性差异（P均>0.05）；未发现膜攻击复合物在肝脏的沉积；C5a-R mRNA 1h、3h较模型组显著上升,蛋白1h、3h、6h较模型组显著上升；②凋亡变化：CVFlh发现肝脏实质细胞凋亡,较模型组显著上升,3h、6h发现肝窦内淋巴细胞凋亡,凋亡细胞计数明显低于模型组;bax mRNA、蛋白、bax/bcl-2蛋白比值、Caspase3表达量在3h、6h较模型组显著下降；3h、24h bcl-2 mRNA、蛋白较模型组显著下降；在CVF组肝脏未发现fas及fasL的表达：③CVF组1h、3h、6h、24h天冬氨酸转氨酶较模型组相应时间点显著下降,但仍高于假手术组。病理评分CVF组1h与假手术组和模型组无显著性差异,CVF3h、6h、24h较模型组显著降低病理评分。第三部分①凉膈散组在1h、3h、6h较模型组显著降低了补体总活性CH50、C5b-9,凉膈散组24hCH50、C5b-9较模型组上升；C5a在1h、3h较模型组显著升高,24h较模型组显著下降；凉膈散组各时间点血天冬氨酸转氨酶（AST）均较模型组显著降低,3h、6h、24h病理评分较模型组显著下降。②凉膈散组3h、6h时发现肝窦内淋巴细胞凋亡,3h凋亡计数较模型组显著降低；凉膈散组在3h和6h能显著降低bax、bax/bcl-2蛋白比值、caspase-3表达量（均P<0.05）,对Bcl-2基因表达无明显影响（均P>0.05）,且未检测到Fas和FasL基因的表达。结论创伤失血性休克时大鼠出现急性肝损害,发现补体的活化,膜攻击复合物C5b-9在肝脏实质细胞的沉积,肝脏实质细胞的凋亡；应用CVF抑制补体活化和应用凉膈散均可抑制肝脏实质细胞的凋亡、促进肝窦内淋巴细胞凋亡、抑制膜攻击复合物的沉积,减少肝脏病理损害,保护肝脏。凉膈散在补体调节方面,能够在早期抑制补体的过度活化;在后期保持一定的补体活性,发挥对组织的保护作用,24h肝脏病理损伤较CVF组减轻。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 创伤失血性休克大鼠模型的建立
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 动物与分组
• 1.1.2 创伤失血性休克模型的制备
• 1.1.3 观察指标
• 1.1.4 观察指标
• 1.2 结果
• 1.2.1 动物模型伤后的生命体征变化
• 1.2.2 动物模型的大体解剖
• 1.2.3 肝脏病理变化
• 1.2.4 24小时动物死亡率
• 1.3 讨论
• 1.3.1 模型制作过程中遇到的困难及解决办法
• 1.3.2 肝损伤
• 1.4 小结
• CVF对创伤失血性休克大鼠肝脏损害的保护机制
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 动物与分组
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 创伤失血性休克模型的制备以及标本制备
• 2.1.4 免疫组化染色
• 2.1.5 细胞凋亡检测
• 2.1.6 酶联免疫吸附试验
• 2.1.7 检测血浆中天冬氨酸转氨酶浓度
• 2.1.8 PCR检测肝脏凋亡基因表达
• 2.1.9 蛋白质印迹
• 2.1.10 病理切片
• 2.1.11 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 补体变化
• 2.2.2 凋亡的检测
• 2.2.3 Caspase3蛋白表达变化
• 2.2.4 血浆中天冬氨酸转氨酶（U/L）及病理变化
• 2.2.5 相关性分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 补体系统
• 2.3.2 蛇毒因子
• 2.3.3 细胞凋亡途径及其调控因素
• 2.3.4 模型组补体及肝脏C5a-R受体变化
• 2.3.5 本实验中模型组凋亡的研究
• 2.3.6 CVF对创伤失血性休克大鼠补体以及肝脏凋亡、C5a-R的影响
• 2.4 小结
• 三、凉膈散对创伤失血性休克大鼠肝脏的保护机制
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 动物与分组
• 3.1.2 创伤失血性休克模型的制备以及标本制备
• 3.1.3 免疫组化染色
• 3.1.4 细胞凋亡检测
• 3.1.5 检测血浆中CH50、C5b-9、C5a浓度
• 3.1.6 检测血浆中天冬氨酸转氨酶浓度
• 3.1.7 PCR检测肝脏凋亡基因、C5a-R基因表达
• 3.1.8 Western blot方法检测肝脏C5a-R蛋白表达
• 3.1.9 病理切片
• 3.1.10 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 血浆补体的变化
• 3.2.2 凋亡检测
• 3.2.3 天冬氨酸转氨酶以及病理评分变化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 凉膈散对补体的调节作用
• 3.3.2 凉膈散对肝脏细胞凋亡的影响
• 3.3.3 凉膈散和CVF在创伤失血性休克大鼠肝损害保护作用机制的差别
• 3.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 补体在创伤中的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢