苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究

论文题目: 苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 郑银英

导师: 王国平

关键词: 苹果茎沟病毒,苹果褪绿叶斑病毒,变异,外壳蛋白,原核表达

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple cholortotic leaf spot virus,ACLSV)是危害梨和苹果及其它一些果树的重要病毒,对果树的生长、产量、果品质量等造成严重的影响。本研究以ASGV和ACLSV为对象研究其生物学、血清学特性和分子变异。目的就是要通过对不同来源分离物的分子变异与生物学和血清学特性的比较分析,从分子水平上探索ASGV和ACLSV生物学多样性和血清学差异与分子变异的关系,结果如下: 1.通过昆诺藜(Chenopodium.quinoa)接种鉴定和ELISA检测,从梨和苹果上获得ASGV 23个分离物。采用TC-RT-PCR对这些分离物进行扩增,均获得特异的扩增片段,PCR产物经5%PAGE电泳,出现大小约500、530和600bp的三种迁移率不同的泳动带型。根据PCR产物电泳迁移率的差异,选取3个来源于梨的分离物P-L4、P-6-1-17和P-3-2-67的PCR产物进行克隆与序列测定。经BLAST搜索,三个分离物的扩增片段与苹果分离物P-209的CP基因3′端核苷酸序列同源性分别为92.2%、90.4%和88.4%。3个分离物间的核苷酸序列也有较大差异,P-L4/P-6-1-17为95.5%、P-L4/P-3-2-67为90.4%、P-6-1.17/P-3-2-67为88.6%。 2.选取生物学和血清学特性上存在较大差异的ASGV梨分离物P-6-1-17、P-4-1-69、P-L2和P-D-21,采用RT-PCR法对3′端进行扩增,所获扩增片段经序列测定,全长分别为1089nt(P-6-1.17、P-L2)和1069nt(P-4-1-69、P-D-21)。4个分离物的CP基因均由714nt组成,其核苷酸和推导编码蛋白氨基酸序列同源性分别为89.8%～96.4%和94.9%～97.9%。将我国4个分离物的CP基因与已报道ASGV分离物及分子变种进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明我国ASGV分离物至少可分为2个组群,其中生物学表现明显不同于其它分离物的P-L2,其CP基因核苷酸序列显示较大的变异。 3.通过昆诺藜接种鉴定和ELISA检测,从梨、苹果和桃上获得ACLSV 13个分离物。用PAS-ELISA和DAS-ELISA对这13个分离物进行检测,结果PAS-ELISA只检出来源于桃的HBP分离物,而DAS-ELISA检出来源于桃的HBP、PE-T-5和PE-5 3个分离物。然而采用RT-PCR和TC-RT-PCR对这些分离物进行扩增,均能获得特异的358bp目标片段。 4.在昆诺藜和苋色藜上均产生系统褪绿症状,且血清学上相关的来源于桃和苹果的HBP、ACLSV-C 2个分离物,通过RT-PCR法分别获得约1.8kb的目标片段。所获扩增片段经序列测定,全长分别为1768nt(GenBank登录号AY728180)和1751nt。2个分离物的CP基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将这2个分离物的CP基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析结果表明,HBP与从苹果和樱桃

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词表

1 文献综述

1.1 生物学特性

1.1.1 寄主范围

1.1.1.1 ASGV地理分布与寄主范围

1.1.1.2 ACLSV地理分布与寄主范围

1.1.2 症状

1.1.2.1 ASGV症状特点

1.1.2.2 ACLSV症状特点

1.1.3 传播途径

1.2 病毒粒子特征、细胞病理学

1.2.1 ASGV病毒特性与细胞病理学

1.2.2 ACLSV病毒特性与细胞病理学

1.3 血清学及株系

1.3.1 ASGV血清学及株系

1.3.2 ACLSV血清学及株系

1.4 ACLSV和ASGV的基因组结构和组成

1.4.1 ASGV基因组及基因产物的特点

1.4.2 ACLSV基因组及基因产物的特点

1.5 ACLSV和ASGV病害的防治

1.5.1 培育和栽培无病毒苗木

1.5.2 病毒检验

1.5.3 控制高接传毒

1.5.4 抗病毒转基因工程

2 研究目的和意义

3 材料和方法

3.1 试剂和仪器

3.1.1 试剂

3.1.2 仪器

3.2 实验材料与方法

3.2.1 材料

3.2.1.1 果树品种

3.2.1.2 草本指示植物

3.2.1.3 接种缓冲液

3.2.1.4 抗体及标准毒源

3.2.1.5 菌株与载体质粒

3.2.1.6 电泳缓冲液和细菌培养基

3.2.2 方法

3.2.2.1 毒源的繁殖

3.2.2.2 血清学检测

3.2.2.3 分子生物学检测

3.2.2.4 病毒目的基因序列的扩增

3.2.2.4 外源基因的原核表达

3.2.2.5 电转移及Western blotting

4 结果与分析

4.1 ASGV生物学、血清学特性与CP基因的克隆与序列分析

4.1.1 ASGV分离及昆诺藜上的症状表现

4.1.2 ASGV的ELISA检测结果

4.1.3 ASGV的TC-RT-PCR检测结果

4.1.4 ASGV PCR产物序列分析结果

4.1.5 ASGV梨分离物CP基因克隆及序列测定结果

4.1.6 来源于不同寄主的ASGV CP基因核苷酸序列分析

4.1.7 来源于不同寄主的ASGV CP氨基酸序列分析

4.1.8 来源于不同寄主的ASGV3′非翻译区(3′NCR)序列分析

4.2 ACLSV生物学、血清学特性与CP基因的克隆与序列分析

4.2.1 ACLSV分离及草本寄主上的症状表现

4.2.2 ACLSV的ELISA检测结果

4.2.3 ACLSV的RT-PCR(TC-RT-PCR)检测结果

4.2.4 ACLSV分离物CP基因克隆及序列测定结果

4.2.5 来源于不同寄主的ACLSV CP基因核苷酸序列分析

4.2.6 来源于不同寄主的ACLSV CP氨基酸序列分析

4.2.7 来源于不同寄主的ACLSV3′端CP基因核苷酸序列分析

4.2.8 来源于不同寄主的ACLSV C端CP氨基酸序列分析

4.2.9 来源于不同寄主的ACLSV MP基因序列分析

4.3 ACLSV HBP分离物CP基因的原核表达

4.3.1 HBP CP基因的RT-PCR扩增

4.3.2 CP基因在大肠杆菌中的表达

4.3.3 CP原核表达产物的Western blotting分析

5 讨论

5.1 ASGV生物学、血清学特性与CP基因的克隆与序列分析

5.1.1 ASGV生物学、血清学特性与分子鉴定

5.1.2 ASGV外壳蛋白基因的克隆与序列分析

5.2 ACLSV生物学、血清学特性与CP基因的克隆与序列分析

5.2.1 ACLSV生物学、血清学特性与RT-PCR检测

5.2.2 ACLSV外壳蛋白基因的克隆与序列分析

5.3 HBP分离物外壳蛋白基因的原核表达

6 参考文献

图版与说明

附录

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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[7].两种麦类病毒的分子群体遗传结构分析[D]. 吴蓓蕾.中国农业科学院2009
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