新生鼠缺氧缺血性脑损伤后心肌calpain-1表达与心肌细胞凋亡的关系研究

论文摘要

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic ischemic brain damage, HIBD）是围生期新生儿窒息引起的脑损伤,是新生儿死亡和导致神经系统后遗症的常见原因。HIBD发病机制复杂,缺氧是基础病理生理改变,血流动力学紊乱是并发多脏器功能衰竭的主要原因。由缺氧引起的HIBD是一个全身性病理过程,缺氧、酸性代谢产物蓄积导致心肌细胞能量代谢障碍,ATP减少,引起心肌损伤；目前对缺氧引发心肌损伤的研究表明,心肌细胞除发生坏死外还发生凋亡,且在缺氧、缺血早期凋亡细胞数多于坏死细胞。Calpains家族是一类存在于细胞质中的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶,底物众多,Calpain的活化参与了HIBD的发生过程,其对心肌细胞凋亡的作用主要表现在对凋亡途径的调节,并对某些凋亡相关基因的激活至关重要。本研究采用新生7日龄Wistar大鼠构建缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型,观察缺氧缺血（HI）对新生大鼠心肌细胞凋亡的影响情况,同时检测心肌组织中Calpain -1 mRNA及蛋白质水平的表达；凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas及Caspase-3mRNA表达的变化规律,以进一步探讨Calpain-1、凋亡相关基因与心肌细胞凋亡之间的相互关系。采用改良的Rice法建立新生大鼠HIBD模型。新生7天大鼠64只,随机分为假手术对照组和HI后2、12、24h、2、3、5及7d组,每组各8只大鼠。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测大鼠心肌组织中Calpain -1、Bcl-2、Bax、Fas及Caspase-3 mRNA的表达；Western blot法观察大鼠心肌组织中Calpain-1蛋白活性的表达情况；脱氧核糖核酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL）检测凋亡细胞的变化,并计算细胞凋亡指数（AI）。1.新生大鼠HI后2h开始凋亡细胞增多,12h-3d各时点凋亡率明显高于对照组（p<0.01）,3d为凋亡的高峰；5d时有所降低,7d仍高于对照组。2.与对照组相比,HI后12h心肌组织中Calpain -1mRNA开始增高,2d达到高峰（P<0.01）,3d-5d表达量下降,但仍显著高于对照组（P<0.01）；Calpain-1裂解为76和80两个片段,两者的比值在HI后2h增高（P<0.05）,24 h-2d显著增高（p<0.01）,3d达到高峰；5d时比值有所下降,7d时与对照组相比无差异。Calpain -1蛋白活性（76KD/80KD）与细胞凋亡率相关（r=-0.853；p<0.01）。3.与对照组相比,HI组Bax mRNAHI后2h开始增高,2d达到高峰,3d-5d开始降低；HI组Bcl-2mRNA表达在HI后2h开始降低,12h-24h基因的表达显著降低（p<0.01）,2d时达到最低水平后又开始逐渐增高,7d时与对照组相比无差异。HI组Bcl-2/Bax比值自2h逐渐降低,2d为最低点,3d-5d比值又逐渐增高,7d时与对照组持平,无统计学意义。Bcl-2/Bax比值与细胞凋亡率负相关性（r=-0.601；p<0.01）4.HI组Caspase-3 mRNA表达水平自HI后HI后2h增高,12h-2d增加显著（p<0.01）,2d时达到高峰；3d-5 d时降低,但是依然高于对照组水平（p<0.01）,7d时与对照组无差异。5.与对照组相比,Fas mRNA自HI后2h出现增高（p<0.01）,12h-2d表达显著增加,与对照组相比差异显著（p<0.01）,3d时达到高峰；5d时降低,7d时依然高于对照组水平（p<0.01）。1.HIBD新生大鼠心肌细胞确实存在凋亡,HI后3d为凋亡的高峰。2.新生大鼠HI后心肌组织Calpain-1 mRNA及蛋白质水平显著增高,与对照组相比差异明显,提示Calpain-1可能参与了缺氧缺血后心肌损伤的发生。3.HI后心肌组织Bax基因表达上调,Bcl-2基因表达下调,随着细胞凋亡率的增加,Bcl-2/Bax比值逐渐降低,两者呈负相关性,表明Bcl-2、Bax参与并介导了心肌细胞凋亡发生。4.HI后组织中Caspase-3和Fas基因表达上调,与细胞凋亡率密切相关,提示Caspase-3和Fas基因可能介导了缺氧诱导的心肌细胞凋亡的调节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 新生鼠缺氧缺血性脑损伤后心肌calpain-1表达与心肌细胞凋亡的关系研究
• 1. 对象和方法
• 1.1 实验对象
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 主要实验仪器和试剂
• 1.2.2 RT-PCR法检测心肌calpain-1及凋亡基因mRNA表达水平
• 1.2.3 Western blot检测calpain-1蛋白活性
• 1.2.4 HE染色
• 1.2.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数
• 1.3 统计学分析
• 2. 结果
• 2.1 实验鼠HIBD建模成功的判定
• 2.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数（AI）
• 2.3 Calpain-1 mRNA表达量的变化
• 2.4 心肌细胞凋亡基因mRNA表达量的变化
• 2.5 Calpain-1蛋白的活性变化
• 2.6 AI与Calpain-1及凋亡基因的相关性
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• Calpains在心肌细胞凋亡中的作用
• 参考文献
• 致谢