广西双生病毒的分子鉴定

论文摘要

双生病毒是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒,已在多种重要经济作物上引起危害。我国已从广东、广西、云南和海南等地的烟草、番茄、南瓜和番木瓜等多种作物上相继发现了多种双生病毒,并对其基因组结构及变异进行了深入研究。双生病毒寄主范围广,变异快。为了明确双生病毒的发生、分布与传播,我们从广西番木瓜、番茄、烟草、一品红、苦苣菜及胜红蓟上采集了32个具有双生病毒典型症状的样品并对病毒进行了分子检测与鉴定。 采集的32个样品用双生病毒的简并引物PA和PB进行了PCR检测,均可扩增到约500bp的片段。克隆后序列测定表明,32个样本均受粉虱传双生病毒侵染,序列比较发现这些病毒分离物至少可分为4种病毒类型。从每种病毒类型中选取代表,共对9个分离物的基因组结构进行了详细研究。 GX-1、GX-2和GX-3为番茄上的分离物,对这三个分离物的全基因组进行了测定,发现其DNA-A全长均为2752个核苷酸（nts）,序列比较表明,它们相互之间的相似性为98.9～99.7%,与中国胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein China virus, AYVCNV）的相似性最高,为86.7%,因此GX-1、GX-2和GX-3是Begomovirus的一个新种,将它命名为广西番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Guangxi virus, ToLCGXV）。对GX-1基因组进一步分析发现,ToLCGXV可能由AYVCNV和中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl China virus, ToLCCNV）及另一未知病毒经过重组产生。DNAβ分子的PCR检测表明,除GX-3外,GX-1和GX-2都伴随有卫星DNA分子,Southern印迹检测发现GX-3确实不伴随DNAβ分子。 GX-4和G121～G128也为番茄上的分离物,对GX-4和G121的全基因组进行了测定,发现分离物GX-4和G121的全序列分别为2738nts和2734nts。GX-4 DNA-A与中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus, PaLCuCNV）具最高相似性,为91.6%。根据双生病毒分类原则,GX-4为PaLCuCNV的一个分离物。而G121 DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）的相似性最高,为96.2%。从番茄上分离的这9个样本中其

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 双生病毒研究进展:文献综述
• 1 双生病毒的危害
• 1.1 双生病毒的危害日益严重
• 1.2 导致双生病毒危害日益加重的原因
• 2 双生病毒的分类命名及其基因组特征
• 2.1 双生病毒属的分类及其基因组特征
• 2.2 双生病毒种的分类及其命名
• 2.3 双生病毒种下分类及其命名
• 3 伴随双生病毒的亚病毒因子（subviral agents）
• 3.1 伴随双生病毒的亚病毒因子种类
• 3.2 伴随双生病毒的亚病毒因子的复制
• 3.3 伴随双生病毒的亚病毒因子的功能
• 3.4 DNAβ的多样性
• 4 双生病毒的增殖和致病机理
• 4.1 双生病毒的复制
• 4.2 双生病毒的转录
• 4.3 双生病毒在寄主植物体内的移动
• 4.4 双生病毒的复制和转录对寄主植物的依赖性
• 4.5 双生病毒的致病机理
• 5 双生病毒基因组的变异
• 5.1 突变
• 5.2 假重组（pseudo-recombination）
• 5.3 重组
• 6 双生病毒的进化
• 7 立题意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 毒源
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 植物材料
• 1.4 常用生化试剂及仪器
• 1.5 常用缓冲液的配制
• 2 方法
• 2.1 植物总 DNA提取（CTAB法）
• 2.2 总 DNA的少量纯化
• 2.3 PCR反应
• 2.4 PCR产物的纯化
• 2.5 DNA克隆技术
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 侵染性克隆的转化
• 2.8 农杆菌接种
• 2.9 Southern印迹分析
• 2.10 核苷酸序列测定
• 2.11 核苷酸序列分析
• 第三章 研究结果
• 第一节 广西省粉虱传双生病毒的快速检测
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总 DNA提取和少量纯化
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 PCR产物的纯化
• 1.5 序列分析
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二节 侵染番茄的双生病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总 DNA提取和少量纯化
• 1.3 PCR扩增、克隆和序列测定
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒基因组 DNA-A的结构
• 2.2 DNA-A与其它双生病毒的相似性比较及进化分析
• 2.3 与病毒伴随的卫星 DNA分子的鉴定及结构特征
• 2.4 田间番茄样本复合侵染的检测
• 3 讨论
• 第三节 广西番茄曲叶病毒的致病性测定
• 1 材料和方法
• 1.1 病毒分离物和 DNA抽提
• 1.2 侵染性克隆的构建
• 1.3 农杆菌介导的植物接种
• 1.4 接种植物 DNA-A和 DNAβ的Southern印迹分析
• 2 结果与分析
• 2.1 GX-1 DNA-A的致病性及寄主范围测定
• 2.2 GX-1与其伴随的DNAβ分子的互作
• 3 讨论
• 第四节 侵染广西烟草的中国番茄黄化曲叶病毒及其伴随的卫星 DNA分子的基因组特征
• 1 材料和方法
• 1.1 毒源
• 1.2 DNA提取
• 1.3 PCR扩增、克隆和序列测定
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒分离物 G102基因组 DNA-A结构
• 2.2 G102 DNA-A与其它双生病毒的同源性比较
• 2.3 与病毒伴随的DNAβ分子结构及与其它己报道 DNAβ的同源性比较
• 3 讨论
• 第五节 侵染番木瓜的双生病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总 DNA提取和少量纯化
• 1.3 DNA-A全长基因组的克隆和序列测定
• 1.4 DNAβ全长基因组的克隆和序列测定
• 1.5 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒基因组 DNA-A的结构
• 2.2 病毒基因组 DNA-A与其它双生病毒的比较及分子进化分析
• 2.3 卫星 DNA分子的检测及结构特征
• 3 讨论
• 第六节 侵染一品红的双生病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总 DNA的提取及病毒 DNA-A全长基因组的克隆和序列测定
• 1.3 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 G35分离物的DNA-A基因组结构及序列分析
• 2.2 G35 DNA-A全长基因组分子进化分析
• 2.3 病毒间的复合侵染
• 3 讨论
• 第七节 侵染苦苣菜的双生病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总 DNA提取
• 1.3 PCR扩增、克隆和测序
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 G129 DNA-A基因组结构
• 2.2 G129 DNA-A与其它双生病毒的比较及分子进化分析
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录 A:病毒缩写与中英文对照
• 附录 B:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录 C:常用缓冲液及培养基配方
• 附录 D: EMBL登录基因