一次性静态芯片实时荧光定量聚合酶链反应方法研究

论文摘要

实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time FQ-PCR）是一种DNA的定量分析方法,它对特定序列的DNA具有灵敏度高、特异性强等特点,在分子生物学及临床医学诊断研究中应用日益广泛。常用的台式定量PCR仪的样品及试剂用量大,在速度及通量方面也难以满足越来越多的分析需要,此外床边护理检验也要求检测系统便携化。因此,定量PCR仪的微型化和通量化成为科研人员关注的焦点。论文第一章对实时荧光定量PCR的研究方法及PCR芯片的研究现状进行了综述,提出在氧化铟锡（ITO）玻璃芯片上进行实时荧光定量PCR进行定量分析的可行性。第二章在已有静态ITO玻璃温控芯片研究的基础上,对温度控制及校正方法进行了进一步的研究,通过在芯片上粘结铜箔的方法提高了PCR反应的可靠性。第三章以倒置荧光显微镜为基本平台初步建立了芯片实时荧光定量PCR检测系统,对激发光源,光电倍增管（PMT）及显微镜的操作条件进行了优化。利用蓝光发光二极管（LED）作为激发光源,在光源电流300 mA,PMT电压600 V,25倍显微物镜下进行了实时荧光检测,取得了较好的结果。第四章在ITO玻璃温控芯片上首次实现了基于静态温控模式的实时荧光定量PCR,以SYBR Green I为荧光染料对λDNA模板的定量方法进行了展示。通过并行反应和一次性使用的方法提高通量的同时也有效地避免了交叉污染问题。在3.8×105～3.8×108初始拷贝范围内取得了很好的线性,标准曲线斜率为-4.9,截距52.5,线性相关系数为0.9989,Ct值变异系数小于5%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 聚合酶链反应（PCR）
• 1.2 实时荧光定量PCR（Real-time FQ-PCR）
• 1.2.1 实时荧光定量PCR原理
• 1.2.2 实时荧光定量PCR的定量方法
• 1.2.3 实时荧光定量PCR的定量技术
• 1.2.4 实时荧光定量PCR的应用
• 1.3 芯片PCR
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 PCR芯片的发展
• 1.3.3 PCR芯片的温度控制
• 1.4 本论文的设计思想
• 第二章 ITO玻璃芯片结构优化及温度表征
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和材料
• 2.2.2 仪器和装置
• 2.2.3 实验步骤
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 ITO玻璃芯片的结构
• 2.3.2 热电偶的制作与校正
• 2.3.3 ITO玻璃芯片上温度的测定
• 2.3.4 反应池内反应体系温度的测定
• 2.4 小结
• 第三章 定量PCR荧光检测系统的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与材料
• 3.2.2 仪器与装置
• 3.2.3 实验步骤
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 激发光源的优化
• 3.3.2 荧光检测装置的优化
• 3.4 小结
• 第四章 芯片实时荧光定量PCR的方法研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与材料
• 4.2.2 仪器与装置
• 4.2.3 实验步骤
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实时荧光定量PCR的温度控制程序的优化
• 4.3.2 芯片实时荧光定量PCR检测λ DNA的标准曲线
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文情况