论文摘要
目的由于细胞膜的选择通透性,大分子物质很难穿过细胞膜进入细胞内部,因此生物膜成了大分子物质作用于人体发挥作用的主要障碍,从而限制了大分子物质如大分子药物的广泛应用。例如多种具有治疗功效的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸等难以进入细胞内部发挥药效,达不到临床应用目的。此外,很多具有应用前景的药物受到人体内各种天然屏障（如血脑屏障）的限制也难以到达靶器官或靶细胞而发挥药效。因此,本实验致力于研究一种蛋白转导域携带工具,它可以携带大分子蛋白药物穿过细胞膜而发挥药效。为进一步解决大分子药物的临床应用奠定基础。方法通过生物信息学软件分析His-EGFP和His-TAT-EGFP的理化性质和二级结构的变化与不同之处,分析得到反式激活蛋白TAT （transactivator protein）并不改变融合蛋白His-TAT-EGFP中EGFP的二级结构及生物学活性,并且与His-EGFP相比,His-TAT-EGFP的亲水性和极性增加,等电点提高。通过质粒构建重组成融合质粒载体,首先把HIV-1 TAT 47-57氨基酸基因序列连接到pET-28a质粒上,将pET-28a-TAT转化到DH5a菌中进行扩增,提取质粒pET-28a-TAT;然后再把绿色荧光蛋白基因序列EGFP连接到构建好的质粒pET-28a-TAT上。将其转化到DH5a菌中进行扩增,提取质粒pET-28a-TAT-EGFP,然后进行酶切鉴定及测序。用同样的方法构建质粒pET-28a-EGFP,作为对照。分别把两种质粒转化到BL21（DE3）菌中,进行表达,当菌液OD为0.6时,加入IPTG,使IPTG终浓度为0.5mM,在37℃、200rpm条件下诱导表达四小时。大量表达出蛋白质后,用His标签的亲和层析柱进行蛋白纯化。得到纯化的蛋白质后,进行体内蛋白质的细胞穿膜实验,两种蛋白His-TAT-EGFP和His-EGFP分别与HeLa细胞和PC12细胞共孵育,经过PBS清洗过后,用荧光显微镜观察两种细胞分别被两种蛋白孵育后的荧光情况。做蛋白浓度梯度与细胞穿膜功能之间量效关系实验,利用不同浓度融合蛋白His-TAT-EGFP与HeLa细胞分别孵育90min,经过PBS清洗和胰酶消化后,用PBS重悬细胞,用流式细胞仪检测细胞穿膜效果。检测融合蛋白穿活体动物细胞膜的活性,给体重为22g左右的健康成年昆明小鼠分别腹腔注射两种蛋白His-TAT-EGFP和His-EGFP,检测融合蛋白His-TAT-EGFP在活体动物体内的细胞穿膜功能,做动物组织心、脑、肝和肾的冰冻切片,然后用荧光显微镜观察切片。利用同样方法构建质粒pET-28a-TAT（-）-EGFP, pET-28a-EGFP-TAT和pET-28a-EGFP-TAT（-）,然后经过表达和纯化后,得到一系列融合蛋白,His-TAT（-）-EGFP、His-EGFP-TAT（+）和His-EGFP-TAT（-）,利用这些融合蛋白进行体外细胞穿膜实验,比较各种不同序列和TAT在融合蛋白中N端或C端位置不同的TAT融合蛋白的细胞穿膜能力差异,从而在融合蛋白中找出不同TAT序列和在融合蛋白中位置不同的TAT融合蛋白的细胞穿膜功能的差异。结果成功地构建了pET-28a-TAT-EGFP和pET-28a-EGFP质粒,并在BL21（DE3）菌中得到了大量表达,经过His标签亲和层析柱进行蛋白纯化得到纯度比较高的两种融合蛋白。经过体外和体内细胞穿膜实验,结果显示表达出的融合蛋白His-TAT-EGFP具有体外和体内细胞穿膜功能,而单纯的His-EGFP蛋白是不具有这种细胞穿膜功能的。并且表明在同样时间的作用下,在一定浓度范围内,细胞穿膜能力与TAT融合蛋白的浓度成正比。成功地构建了融合质粒pET-28a-TAT（-）-EGFP, pET-28a-EGFP-TAT和pET-28a-EGFP-TAT（-）,并表达纯化出几种蛋白His-TAT（-）-EGFP, His-EGFP-TAT（+）和His-EGFP-TAT（-）,并且对几种融合蛋白分别进行了体外细胞穿膜实验,成功进行了TAT不同序列和在融合蛋白中不同位置的TAT融合蛋白的细胞穿膜功能比较,得到四种融合蛋白细胞穿膜能力不尽相同的结果,而His-EGFP-TAT（-）相对来说穿膜能力较强。结论蛋白转导域具有强大的携带大分子蛋白质细胞穿膜的功能。通过质粒构建可以表达出具有穿过生物膜功能的蛋白转导域和绿色荧光蛋白的融合蛋白,并且找出不同序列和在融合蛋白中N或C端的不同位置的TAT融合蛋白细胞穿膜能力的差异,并且经过研究验证了不同序列TAT和在融合蛋白中位置不同的TAT穿膜能力不尽相同,在融合蛋白中处于C端的反向序列的融合蛋白细胞穿膜能力较强,并且在一定浓度范围内的穿膜能力会随浓度升高而穿膜能力增强,并且各种融合蛋白穿膜机制与膜受体无关,属于被动运输的一种,各种融合蛋白对细胞无创伤作用,为下一步开发大分子新药成功建立了技术平台。
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