基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因突变检测中的应用研究

论文摘要

目的:研究高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因缺失突变检测中的应用。方法:选取与肺癌密切相关的EGFR基因19号外显子上的两种非移码缺失突变del E746–A750(del 2235–2249)和del L747–P753 insS(del 2240–2257),即15nt和18nt缺失突变为检测靶点,分别设计3’末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,并硫化磷酸修饰;采用高保真DNA聚合酶联合3’末端硫代修饰的特异性引物所构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应缺失突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行分析和方法评估。在48℃到68℃大范围退火温度下,采用梯度PCR结合凝胶电泳,比较了有硫化修饰和无硫化修饰引物,在高保真酶介导的缺失突变检测中的区别;比较了Taq酶与Pfu酶介导的3’硫化修饰特异性引物延伸反应在缺失突变检测中的特异性及可靠性。对6例肺癌患者的组织样品进行了筛查。采用荧光定量PCR,评估高保真酶介导的敏感性分子开关在荧光定量PCR中的敏感性和相关性。结果:高保真酶介导的敏感性分子开关准确识别了肺癌EGFR基因15nt和18nt的缺失突变。在48°C到68°C大范围退火温度下,敏感性分子开关在突变模板上得到特异性的扩增产物,而在野生模板上起到“关”的效应,特异性随退火温度提高而增强。重组质粒定量后,稀释成10~8、10~7、10~6、10~5、10~4、10~3、10~2、10~1拷贝数/μl浓度梯度作为阳性模板,显示敏感性分子开关在普通PCR结合凝胶成像电泳中,15nt缺失突变检测分子开关可检测的起始拷贝数为3000突变分子,而18nt缺失突变检测分子开关敏感性更高,可检测的起始拷贝数为10突变分子。对照组中,采用Taq DNA聚合酶或3’末端无硫代修饰的特异性引物,均易产生假阳性且呈退火温度依赖性。将上述15nt缺失突变阳性模板用于制定荧光定量PCR的标准曲线,结果显示,定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.990。对6例非小细胞性肺癌患者的肺组织样本进行检测,发现1例含有15nt缺失突变。由于该标本体细胞突变含量较少,低于实际序列分析所检测范围的敏感度。结论:(1)高保真酶介导的基因突变敏感性分子开关除可用于点突变识别外,还可用于识别基因序列中的小缺失突变;(2)高保真酶介导的基因突变敏感性分子开关与荧光定量PCR相结合,可用于小缺失突变的定量分析;(3)高保真酶介导的基因突变敏感性分子开关可用于体细胞突变检测。

论文目录

• 中文摘要
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• 论文正文
• 引言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 实验讨论
• 实验结论
• 参考文献
• 附录
• 文献综述
• 成果目录
• 致谢