人扭转蛋白A的基因克隆表达及蛋白质纯化

论文摘要

原发性扭转痉挛是一组由于躯干、肢体、颈部或颜面肌肉协调功能失调而出现各种姿势的异常或肢体的扭转，已有14种类型的扭转痉挛被定位。常染色体显性早发性扭转痉挛定位于9q34，是一种最常见、最为严重的扭转痉挛，1989年Ozelius等将该基因命名为DYT1，1997年又克隆出该基因，它编码332个氨基酸组成的DYT1扭转蛋白A（Torsin A），该蛋白是腺苷三磷酸酶AAA家族的成员，一种ATP结合蛋白，它与许多细胞活动有关。DYT1基因突变可引起9q连锁的扭转痉挛。 在实验中，我们从人扭转蛋白A的编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板，成功地扩增到编码DYT1蛋白的基因片段，该片段全长939bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂法提取质粒，通过PCR和酶切分析，成功地筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致。 提取质粒，用BamH I和Xho I酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（+）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，成功地构建了人扭转蛋白A原核表达载体。将该工程菌接种于含有适当抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日将此菌液按1：100的比例接种于250mL LB液体培养基中，37℃振荡培养，当细菌长至适当的密度时，加入IPTG（终浓度为1mM）诱导，继续培养约5h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE，结果在两种载体中均得到了高效表达。在pET28a（+）中表达的DYTI蛋白为包含体（IBS），经过IBS制备、蛋白质复性、金属鳌合层析纯化、superdex75凝胶过滤纯化，得到了纯的DYTI蛋白;在pGEX一6P一1中表达的DYTI蛋白与GST的融合蛋白也为IBS，但此融合蛋白复性不好，只得到极少量的融合蛋白。关键词:人;OYTI基因;扭转蛋白A;cDNA;克隆;原核表达;蛋白质纯化

论文目录

• 0 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验器材
• 1.1.2 工具酶和各种试剂
• 1.1.3 载体和感受态细胞
• 1.1.4 层析介质和设备
• 1.1.5 有关样品
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 基因背景
• 1.2.2 PCR引物设计与合成
• 1.2.3 PCR扩增
• 1.2.3.1 犷增
• 1.2.3.2 DNA片段的回收
• 1.2.4 克隆载体的构建与鉴定
• 1.2.4.1 人DYT1基因的克隆
• 1.2.4.2 阳性克隆的筛选
• 1.2.5 表达载体的构建与鉴定
• 1.2.5.1 表达载体的构建
• 1.2.5.2 阳性克隆的筛选
• 1.2.6 表达
• 1.2.6.1 试表达
• 1.2.6.2 表达
• 1.2.7 纯化
• 1.2.7.1 包含体的制备
• 1.2.7.2 复性
• 1.2.7.3 亲和层析
• 1.2.8蛋白质生物学信息分析
• 1.2.8.1跨膜分析
• 1.2.8.2蛋白质基本理化特性分析
• 2 结果
• 2.1 PCR扩增
• 2.2 PCR产物克隆及克隆质粒鉴定
• 2.3 表达载体的构建
• 2.3.1 DYT1—pET28a表达载体的构建
• 2.3.2 DYT1—pGEX-6P-1表达载体的构建
• 2.4 表达
• 2.4.1 DYT1在pET28a中的表达
• 2.4.2 DYT1在pGEX-6P-1中的表达
• 2.5 纯化
• 2.5.1 包含体的制备
• 2.5.2 复性
• 2.5.3 亲和层析
• 2.5.4 凝胶过滤
• 2.6生物信息学分析
• 2.6.1跨膜分析
• 2.6.2基本理化特性
• 3 讨论
• 3.1 基因克隆表达技术
• 3.2 DYT1在原核系统中的表达
• 3.3 DYT1研究状况
• 4 小结
• 5 附录
• 附录一：实验试剂
• 附录二：DNA琼脂糖凝胶电泳
• 附录三：质粒DNA的提取
• 致谢
• 参考文献