生物催化生产十三碳二元酸中β-氧化途径的代谢调控

论文题目: 生物催化生产十三碳二元酸中β-氧化途径的代谢调控

论文类型: 博士论文

论文专业: 化学工程与技术

作者: 高弘

导师: 曹竹安

关键词: 热带假丝酵母,二元酸,基因重组,肉毒碱乙酰转移酶,补料发酵

文献来源: 清华大学

发表年度: 2005

论文摘要: 长链α,ω-二元酸是一种重要的精细化学产品。热带假丝酵母(Candida tropicalis)可以利用烷烃和脂肪酸通过生物氧化来合成从C11到C18的长链二元酸,代谢过程中二元酸的过度β-氧化会造成产品得率下降。本文以热带假丝酵母生产十三碳二元酸过程中的β-氧化途径为研究对象,对代谢工程的应用进行了探索研究,首次通过调节β-氧化与三羧酸循环之间的乙酰辅酶A转运系统,达到调节β-氧化代谢流量和提高烷烃转化率的目的,丰富了真核细胞传输系统的改造方法和工业微生物的技术手段;还从提供辅助能源取代β-氧化提供能量的角度出发,提出了有效提高产酸水平的方法。改造乙酰辅酶A转运系统的关键酶——肉毒碱乙酰转移酶(CAT),构建了CAT基因单拷贝缺失菌CZ-15,其生长和形态与原始菌F10-1相似。二元酸生产发酵实验中,CZ-15比原始菌F10-1的二元酸终浓度提高了18.3%,烷烃转化率提高了12.0 %,其遗传特性能够稳定传代。利用热带假丝酵母代谢网络对发酵数据进行分析,在CZ-15中由CAT转运进入三羧酸循环的乙酰辅酶A降为F10-1中的50 %左右,十三碳二元酸进入β-氧化的流量也明显降低,说明CAT酶活的下降有效减少了脂肪酸在β-氧化中的无谓消耗。构建了CAT基因双拷贝缺失菌CKC-11。在CKC-11中检测不到CAT酶活。当以烷烃为碳源时,CKC-11无法生长和产酸,说明CAT酶的完全阻断对细胞的能源供应系统造成了严重的影响。根据这一结果,进一步完善了热带假丝酵母中的二元酸代谢途径。尝试在热带假丝酵母的产酸期分别补加NaAc和蔗糖。结果表明,通过提供辅助能源的方式也可以提高热带假丝酵母的产酸和烷烃转化率。

论文目录:

摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 长链二元酸概述

1.2 十三碳二元酸的生产方法

1.3 长链二元酸的生产现状

1.4 同化烷烃及生产长链二元酸的微生物

1.5 热带假丝酵母中烷烃的代谢途径

1.6 脂肪酸代谢中肉毒碱脂酰转移酶的作用与调控

1.7 代谢工程

1.8 基因重组技术

1.9 本论文的研究内容

第2章 CAT 基因单拷贝缺失基因工程菌的构建及性能的初步研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 CAT 的酶活测定方法

2.4 CAT 酶活测定方法的建立

2.5 CAT 基因单拷贝缺失基因工程菌的构建与筛选

2.6 CAT 基因单拷贝缺失基因工程菌性能的初步研究

2.7 小结

第3章 CAT 基因单拷贝缺失菌的二元酸生产实验与代谢流分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 菌株F10-1 和CZ-15 的发酵产酸研究

3.4 代谢流分析

3.5 小结

第4章 CAT 基因双拷贝缺失基因工程菌的构建及性能研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 CAT 基因双拷贝缺失基因工程菌的构建与筛选

4.4 CAT 基因双拷贝缺失基因工程菌性能的初步研究

4.5 原始菌和重组菌对不同碳源的代谢情况

4.6 小结

第5章热带假丝酵母β-氧化过程与脂酰CoA 转运系统的研究.

5.1 前言

5.2 热带假丝酵母中的CPT 和COT 酶活测定

5.3 脂酰CoA 转运系统

5.4 十三碳二元酸进入过氧化物酶体的方式

5.5 修正后的模型对实验现象的解释

5.6 乙酰CoA 从线粒体运出的方式

5.7 小结

第6章热带假丝酵母补加碳源发酵研究

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.3 补加乙酸钠的初步研究

6.4 补加蔗糖的研究

6.5 小结

第7章结论与展望

7.1 结论

7.2 工作展望

参考文献

致谢

附录A 主要实验仪器及试剂

一实验仪器

二实验试剂

三试剂盒

附录B E. COLI 感受态细胞的制备及质粒转化

附录C 质粒DNA 的制备

附录D 酵母细胞的LICL 转化法

附录E 热带假丝酵母的分类、形态、生理生化特性

附录F 烷烃代谢过程中的超微结构

个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果

个人简历

在学期间发表的学术论文和研究成果

发布时间: 2007-03-14

生物催化生产十三碳二元酸中β-氧化途径的代谢调控

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