中枢NO/NOS在针刺改善心肌缺血中的作用及机制

论文摘要

研究背景：心血管疾病危害人类健康,心肌缺血是常见的心血管疾病。随着人民生活水平的提高和社会竞争压力的增大,心肌缺血发病率逐年上升并呈低龄化趋势。因此如何找到一种降低心肌缺血死亡率,改善心肌缺血的治疗方法成为国内外研究的热点。近年来,国内外研究表明电针内关穴（EA PC6）对治疗心肌缺血有其独特的疗效,而延髓头端腹外侧区（rostral ventrolateral medulla, RVLM）作为心血管调控的中枢部位也可能参与其中,但其机制非常复杂。1980年,Furchgott等在家兔大动脉条标本中发现一种被他们称为内皮舒张因子（endothelium-derived relaxing factor, EDRF）的物质,1987年又由他自己将这种物质确定为一氧化氮（nitric oxide, NO）。随着研究的深入,人们逐渐认识到,NO作为一种非经典的信使物质,广泛存在于体内各组织器官,参与体内的许多功能活动,具有重要的调节作用。NO在心血管调节中枢RVLM也存在,并且参与RVLM对心血管的调节。另外近年研究证实,RVLM区的腺苷（ADO）及其A2A受体（A2AR）也参与心血管效应。那么,中枢NO/NOS是否参与电针改善心肌缺血的机制呢?其调节作用是否与RVLM有关?A2AR与NO/NOS系统的关系如何?目前这些机制仍不很清楚。目的：本课题在急性心肌缺血（AMI）大鼠模型上,观察电针内关穴对急性心肌缺血大鼠心血管反应是否有积极调整作用,从功能学和形态学的角度,观察AMI组和AMI+EA PC6组大鼠心血管调节中枢RVLM的NOS的表达,来分析电针内关穴对心肌缺血大鼠的心血管作用是否与RVLM区NO/NOS系统有关,并进一步观察RVLM区NO/NOS与ADO/A2AR的关系,分析NO/NOS调节心血管活动的作用途径,更深入的探讨电针内关穴改善心肌缺血的中枢神经递质或调质机制。方法：采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备AMI大鼠模型；针刺穴位选择双侧“内关”穴（PC6）,针刺对照穴位选择双侧“列缺”穴（LU7）；并监测大鼠平均动脉压（MAP）,心率（HR）。采用氯化四唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色检测心肌缺血是否成功,苏木精和伊红（HE）染色观察缺血心肌组织病理改变,采用超声心动图观察缺血心脏的室壁结构和心功能变化。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定各组大鼠血浆肾上腺素（E）和去甲肾上腺素（NE）的含量,观察心肌缺血后心脏自主神经变化,并通过心率变异性（HRV）和压力感受反射敏感性（BRS）分析系统分析大鼠心脏自主神经功能状态。采用免疫组织化学（IHC）方法检测各组大鼠（Sham组、AMI组、AMI+EA PC6组、AMI+EALU7组）RVLM区nNOS和iNOS的表达；采用蛋白免疫印迹法（western blot）检测各组大鼠（Sham组、AMI组、AMI+EA PC6组）RVLM区nNOS和iNOS蛋白水平的变化。采用硝酸还原酶法检测各组大鼠（Sham组、AMI组、AMI+EA PC6组）RVLM区NO含量及NOS、iNOS活性。采用中枢核团RVLM微量注射的方法观察各组大鼠（正常对照组、Sham组、AMI组、AMI+EA PC6组）RVLM区注射L-Arg （NO的供体）,L-NAME（非选择性NOS抑制剂）,AG（选择性iNOS抑制剂）和7-NI（选择性nNOS抑制剂）,对MAP, HR及HRV各项指标（LF、HF、LF/HF）的影响,及A2AR的拮抗剂（SCH58261）对L-Arg心血管效应的影响。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）观察正常对照组大鼠RVLM区微量注射L-Arg以后RVLM区ADO和ACh变化及微量注射SCH58261+L-Arg后RVLM区ACh的变化;采用western blot检测正常对照组大鼠RVLM微量注射L-Arg后RVLM区A2AR和M1R的蛋白变化及微量注射SCH58261+L-Arg后M1R的蛋白表达变化。结果：（1）AMI模型制备：冠状动脉左前降支结扎后,大鼠立即出现心电图S-T段抬高,结扎线远端心肌发白,收缩力降低,运动减弱,说明AMI模型制备成功。TTC及HE染色显示AMI后心肌组织缺血梗死及EA后的心肌组织缺血情况改善,超声心动图显示AMI后收缩期和舒张期左室内径增大,室间隔厚度变薄,射血分数降低,EA内关穴以后收缩期舒张期左室内径减小,室间隔厚度增厚,射血分数升高,进一步说明AMI模型制备成功和EA的治疗作用。（2）血清E与NE含量测定及HRV和BRS监测：AMI大鼠血清中E与NE比Sham组大鼠血清中E和NE明显增多（P<0.05, n=6）, EA PC6后两者含量明显降低。AMI大鼠HRV和BRS分析显示,HRV和BRS的LF、HF降低（P<0.05,n=6）,但LF/HF明显升高（P<0.05, n=6）, EA PC6后可降低LF/HF比值（P<0.05,n=6）,EALU7后LF/HF比值与AMI组没有明显区别（P>0.05,n=4）。（3）免疫组织化学结果显示：AMI大鼠RVLM的nNOS阳性神经元数目与Sham组相比明显升高,iNOS阳性神经元数目与Sham组相比明显降低（P<0.05,n=6）, EAPC6后的nNOS阳性神经元数目降低（P<0.05, n=6）, iNOS阳性神经元数目升高（P<0.05,n=6）,而EALU7后RVLM区nNOS和iNOS免疫阳性神经元数目与AMI组相比无明显变化（P>0.05,n=4）。（4） Western blot结果显示：NOS蛋白在各组大鼠RVLM均有表达,与Sham组相比,AMI组大鼠RVLM的nNOS蛋白表达增多（P<0.05, n=4）, iNOS蛋白表达减少（P<0.05, n=4）, EAPC6后RVLM的nNOS蛋白表达降低（P<0.05,n=4）,iNOS蛋白表达增多（P<0.05,n=4）。（5）用硝酸还原酶法检测各组大鼠NO含量及NOS活性试剂盒检测NOS,iNOS活性,结果显示：AMI组大鼠血浆和RVLM的NO含量与Sham组相比明显增多（P<0.05, n=8）, NOS活性也明显增强（P<0.05,n=8）,而iNOS活性减弱。EAPC6后AMI组大鼠血浆和RVLM的NO含量增多（P<0.05, n=8）, NOS和iNOS活性增强（P<0.05,n=8）。（6）正常大鼠RVLM区微量注射L-Arg能使大鼠MAP、HR以及HRV各项指标（LF, HF, LF/HF）均降低（P<0.05, n=12）; RVLM区微量注射L-NAME能使大鼠MAP、HR和HRV各项指标（LF,HF, LF/HF）均升高（P<0.05,n=8）。并且L-Arg能使正常大鼠RVLM区的ADO （P<0.05, n=8）, A2AR （P<0.05, n=4）升高,使RVLM区的ACh （P<0.05, n=8）, MIR （P<0.05, n=4）降低。预先在正常大鼠RVLM区微量注射A2AR拮抗剂SCH58261, 10min后再微量注射L-Arg, L-Arg的上述功能被阻断（P<0.05,n=10）。正常大鼠RVLM区微量注射iNOS和nNOS拮抗剂AG和7-NI。AG使MAP、HR、LF、HF、LF/HF比值均升高（P<0.05,n=8）,7-NI使MAP、HR、LF、HF、LF/HF比值均降低（P<0.05,n=8）。（7） AMI+EA PC6组RVLM区微量注射L-NAME能阻断EA PC6对AMI大鼠心血管的改善作用（P<0.05,n=7）。（8）各组（Sham组、AMI组、AMI+EA PC6组）大鼠RVLM微量注射L-Arg能使大鼠MAP和HR降低（P<0.05或P<0.01,n=7）,并且降低幅度在AMI大鼠更明显。同时L-Arg也能使三组大鼠LF/HF降低,AMI组降低最明显。结论：（1）采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法,能成功制备急性心肌缺血模型,该模型大鼠外周交感紧张性增高。这可能与AMI大鼠RVLM区nNOS表达上调及iNOS表达及活性下调有关。（2）电针AMI大鼠内关穴,可以降低AMI大鼠交感紧张性,改善大鼠平均动脉压和心率,改善HRV和BRS。电针的调节机制可能是通过调节NO/NOS的表达,调节交感紧张性,改善心肌缺血。（3）正常大鼠RVLM区NO通过增加ADO释放,激活A2AR活性,进而降低ACh释放及M1R活性,从而降低交感兴奋性,影响心功能。（4）电针内关穴改善心肌缺血作用的中枢机制之一可能是通过调节RVLM区NOS的表达及活性,增加ADO释放,激活A2AR活性,进而降低ACh释放及M1R活性,从而调整交感紧张性,改善心肌缺血。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 实验动物及一般处理
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用试剂配制及处理
• 2. 方法
• 2.1 急性心肌缺血大鼠模型制备
• 2.2 血流动力学和心肌力学指标测定
• 2.3 大鼠内关穴位定位和针刺参数选择
• 2.4 心肌组织TTC染色
• 2.5 心肌组织形态学切片制作
• 2.6 心脏超声检测
• 2.7 血清制备及E和NE测定
• 2.8 大鼠脑组织取材及标本处理
• 2.9 免疫组织化学方法
• 2.10 蛋白免疫印迹实验（western blot）
• X）的检测'>2.11 RVLM区一氧化氮的代谢产物（NO_X）的检测
• 2.12 中枢核团RVLM微量注射
• 2.13 脑片中性红染色步骤
• 3. 实验数据统计学处理
• 结果
• 1. 急性心肌缺血大鼠模型的制备及电针对急性心肌缺血大鼠心率变异性和压力感受反射敏感性的影响
• 1.1 急性心肌缺血模型的制备
• 1.2 超声心图显象改变
• 1.3 大鼠心肌组织TTC染色
• 1.4 大鼠心肌病理形态学的改变
• 1.5 大鼠血清肾上腺素（E）和去甲肾上腺素（NE）含量测定
• 1.6 针刺对心率变异性（HRV）的影响
• 1.7 针刺对压力感受反射敏感性（BRS）的影响
• 2. 电针对AMI大鼠RVLM区NOS表达的影响
• 2.1 电针对RVLM区nNOS免疫反应阳性神经元表达的影响
• 2.2 电针对RVLM区iNOS免疫反应阳性神经元表达的影响
• 2.3 电针对RVLM区nNOS蛋白表达的影响
• 2.4 电针对RVLM区iNOS蛋白表达的影响
• 3. 电针对血浆和RVLM区NO含量及NOS活性的影响
• 3.1 电针对血浆和RVLM区NO含量的影响
• 3.2 电针对血浆和RVLM区NOS活性的影响
• 4. 正常大鼠RVLM的NO,ADO调节心血管功能的机制
• 4.1 RVLM微量注射位点的鉴定
• 4.2 RVLM微量注射L-Arg后对心血管活动的影响
• 4.3 RVLM微量注射L-NAME后对心血管的影响
• 4.4 大鼠RVLM区预先注射A2AR拮抗剂对L-Arg心血管效应的影响
• 4.5 大鼠RVLM注射L-Arg及A2AR拮抗剂对ADO和A2AR及ACh和M1R的影响
• 4.6 RVLM微量注射iNOS抑制剂AG后对心血管的影响
• 4.7 RVLM微量注射nNOS抑制剂7-NI后对心血管的影响
• 5. AMI大鼠RVLM的NO,ADO如何调节心血管功能以及电针调节心血管作用的机制
• 5.1 电针调节心血管功能与大鼠RVLM的NO关系
• 5.2 Sham组大鼠RVLM的NO,ADO如何调节心血管功能
• 5.3 AMI组大鼠RVLM的NO,ADO如何调节心血管功能
• 5.4 EA组大鼠RVLM的NO,ADO如何调节心血管功能
• 5.5 Sham组,AMI组,AMI+EA PC6组大鼠RVLM微量注射L-Arg后心血管功能指标变化的比较
• 5.6 Sham组,AMI组,AMI+EA PC6组大鼠RVLM微量注射L-Arg后HRV变化的比较
• 讨论
• 1. 急性心肌缺血（AMI）模型制作改进
• 2. 针刺调节交感活性与改善心肌缺血的关系
• 3. HRV、BRS与心肌缺血的关系
• 4. 电针对AMI大鼠nNOS,iNOS在RVLM表达的影响及对NO含量,NOS活性的影响及其可能意义
• 5. 正常大鼠RVLM的NO/NOS如何调节心血管功能
• 6. ADO介导NO参与电针对心肌缺血的调节作用
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 综述
• 参考文献