番茄AFLP分子遗传连锁图谱的构建及抗病基因Multi-caps标记识别体系建立

论文摘要

本研究利用优良栽培番茄品系99165-30与高抗晚疫病不同生理小种的野生多毛番茄LA1777远缘杂交，所获得的F2及其以后世代单粒传得到的F5:6代重组自交系分离群体构建番茄永久饱和的分子遗传图谱，并利用荧光AFLP技术，构建了番茄遗传连锁图谱框架图。同时，针对目前生产中番茄主要病害，利用番茄分子生物学研究的信息和近等基因系，建立了番茄抗番茄根节线虫病基因Mi基因、抗番茄斑萎病毒病基因SW-5基因、抗番茄花叶病毒基因Tm22基因、Tm-1基因、Tm-2基的SCAR标记稳定扩增体系，并在此基础上开发了可以对Mi、Tm22、Sw-5等2个及3个抗病基因同时鉴定筛选的多重PCR体系。主要结果如下： 1．利用银染AFLP方法，从64对E/M的AFLP引物组合中筛选出20对扩增清晰、再现性好的多态性引物；20对引物共扩增出274条多态性条带，平均每对AFLP引物组合扩增出13.7个多态性谱带，其多态性谱带高于目前其他分子标记方法，说明这种方法是一种高效的建图方法。 2．首次利用荧光AFLP方法，对RIL群体中产生分离的274个AFLP标记用JoinMap3.0软件进行分析，得到一张包含125个标记的18个连锁群的遗传图谱，覆盖基因组长度为662cM，标记间平均图距为5.3cM。连锁群长度集中在14～58cM之间，连锁群上的标记数在3～22之间。故此连锁群遗传图谱标记数目高于其他方法。 3．以分别含有五种抗病基因的番茄近等基因系为试材，建立了番茄抗病基因的SCAR-CAPS优化体系，即：50ng模板DNA、2.5μl 10×PCR buffer、200μM dNTPs、1．5UTaq DNA聚合酶、1.5-2.5mM Mg2+，每个引物的浓度为0.2μM，最终体积为25μl。 4．利用上述番茄抗病基因的SCAR-CAPS优化体系，以含五种抗病基因的番茄近等基因系为试材，并利用所设计的5种SCAR正反引物进行扩增，结果表明： ①SCAR1正反引物进行扩增，无论是抗根结线虫材料还是感病材料均只扩增出750bp的特异性片段；经TaqⅠ酶切后，抗根结线虫纯合基因型及杂合基因型材料均存在酶切位点，其中纯合基因型Motelle和Mogeor抗病材料分别产生了570bp和180bp大小的特异性片段，而感病纯合基因型Moneymaker、Movione、Mobaci、Moperou、Mospomor不可以被TaqⅠ切开，仍然呈现原来的750bp的片段。说明利用本引物可用于番茄Mi抗病基因辅助选育。 ②SCAR2正反引物进行扩增试材，只有抗斑萎病材料显性片段为400bp，即抗斑萎病基因型材料产生了400bp的特异产物，感病材料均无PCR产物。且PCR产物无TaqⅠ酶切、HindⅢ酶位点。可用于番茄Sw-5抗病基因辅助选育。 ③SCAR3正反引物扩增试材，无论是抗病材料还是感病材料均都扩增出950bp的特异性片段，经HindⅢ酶切后，纯合感病基因型材料存在酶切位点，其中纯合感病基因型Moneymaker、Motelle、Movione、Mobaci、Moperou、产生了500bp和450bp大小的

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 番茄分子标记和遗传图谱的研究进展
• 1 分子标记研究进展
• 1.1 遗传标记的发展
• 1.2.AFLP标记
• 1.3.番茄分子标记的研究进展
• 2 遗传图谱研究进展
• 2.1 图谱构建的理论基础
• 2.2 作图群体的建立
• 2.3 分子标记遗传图谱的构建
• 2.4 遗传图谱的研究意义
• 2.5 番茄分子遗传图谱的研究进展
• 3 本论文的目的意义和技术路线
• 3.1 本论文的目的意义
• 3.2 分子标记与遗传图谱构建研究在植物育种上的联系
• 3.3 本研究的技术路线及总体设计
• 第二章 番茄AFLP分子遗传图谱的构建与分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因组DNA的提取与纯化:（CTAB小量法）
• 2.2.2 AFLP分析（银染—用于引物筛选）
• 2.2.3 Li-cor AFLP（荧光引物AFLP—图谱构建）
• 3 结果与分析
• 3.1 模板DNA制备及单酶切检测
• 3.2 AFLP反应条件的优化
• 3.3 AFLP引物筛选及多态性分析
• 5-6群体构建的AFLP分子遗传图谱及其基本特征'>3.4.利用番茄F_5-6群体构建的AFLP分子遗传图谱及其基本特征
• 3.5 番茄AFLP遗传连锁图谱
• 4 讨论
• 4.1 AFLP遗传图谱构建效率检测方法评价
• 4.2 作图群体的选用
• 4.3 分子标记的偏分离及偏分离产生的机制
• 4.4 遗传图谱覆盖的范围及影响
• 4.5 图谱的比较和完善
• 4.6 开展图谱合并的必要性和可行性
• 4.7 连锁群的染色体定位分析
• 5 小结
• 第三章 番茄抗病分子标记的Multiplex-CAPS体系的建立
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因组DNA的提取与纯化:（CRAB大量法）
• 2.2.2 SCAR反应
• 2.2.3 双引物Mutiplex-CAPS反应体系
• 2基因三引物Mutiplex-CAPS反应体系'>2.2.4 Mi基因、SW-5基因和Tm2²基因三引物Mutiplex-CAPS反应体系
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄SCAR优化反应体系的建立
• 3.2 番茄五种抗病基因的近等基因系的SCAR-CAPS结果
• 2基因双引物Mutiplex-CAPS反应结果'>3.3 Mi基因、SW-5基因和Tm2²基因双引物Mutiplex-CAPS反应结果
• 2基因三引物Mutiplex-CAPS反应结果'>3.4 Mi基因、SW-5基因和Tm2²基因三引物Mutiplex-CAPS反应结果
• 4 讨论
• 4.1 SCAR标记技术的关键
• 4.2 分子标记用于辅助育种的可能性
• 5 小结
• 第四章 番茄抗病分子标记Multiplex-CAPS体系的验证及其在育种上的应用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因组DNA的提取与纯化
• 2.2.2 SCAR反应
• 2.2.3 单引物SCAR反应体系验证
• 2.2.4 双引物Mutiplex-CAPS反应体系验证
• 2基因三引物Mutiplex-CAPS反应体系'>2.2.5 Mi基因、SW-5基因和Tm2²基因三引物Mutiplex-CAPS反应体系
• 2.2.6 番茄叶霉病高抗基因Cf-9的SCAR-CAPS标记创建
• 2.2.7.Cf-9基因和Tm-1基因双基因同时鉴定
• 3 结果与分析
• 2基因紧密连琐特异标记片段的获得'>3.1 与Mi、Sw-5、Tm2²基因紧密连琐特异标记片段的获得
• 2基因双引物Mutiplex-CAPS鉴定结果'>3.2 Mi基因、SW-5基因和Tm2²基因双引物Mutiplex-CAPS鉴定结果
• 2基因三引物Mutiplex-CAPS鉴定结果'>3.3 Mi基因、SW-5基因和Tm2²基因三引物Mutiplex-CAPS鉴定结果
• 3.4 番茄叶霉病高抗基因Cf-9的SCAR-CAPS标记创建
• 3.5 Cf-9基因和Tm-1基因双基因同时鉴定
• 4.讨论
• 5.结论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 陈丽静同志的简历
• 攻读博士论文期间发表的学术论文
• 论文图表统计