蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道渗透调节机制研究及拟南芥TPC1基因的克隆与鉴定

论文题目: 蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道渗透调节机制研究及拟南芥TPC1基因的克隆与鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 张伟

导师: 武维华

关键词: 蚕豆,保卫细胞,通道,渗透势,膜片钳,电压钳,拟南芥,花粉,内向通道

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 胞质自由Ca2+是植物细胞普遍存在的第二信使,介导植物对体内外多种刺激产生相应反应。细胞质膜钙通道介导的Ca2+向胞质的转运对于胞质钙信号产生至关重要,因此,对植物细胞质膜钙通道进行研究并了解其调控机制,对于植物细胞信号转导网络研究具有重要意义。本论文第一部分工作以蚕豆保卫细胞为实验材料,利用膜片钳等技术手段,对保卫细胞质膜钙通道进行记录、鉴定并对其调控因素进行研究,提出了渗透势在调控气孔运动过程中可能的作用机制。利用Ba2+作为通透性离子在全细胞水平记录到内向电流,逆转电位及抑制剂实验分析表明,该电流为Ba2+通过质膜钙通道内流形成。渗透势和微丝参与了全细胞钙通道电流的调控,胞外低渗和微丝解聚剂可以激活通道电流,且渗透势的作用是通过改变微丝结构进而调控通道的活性。单通道水平在蚕豆保卫细胞质膜上记录到张力激活型和电压依赖型两类钙通透性通道,其中张力激活型钙通道的激活依赖于质膜所受的张力,开放几率与张力大小成正比,张力激活型钙通道的开放还受跨膜电位调控,通道电流幅度与质膜超极化程度成正比,本实验条件下记录到的张力激活型钙通道电导为19.7 pS;蚕豆保卫细胞质膜上还存在有电压依赖型钙通道,其激活依赖于质膜超极化,单通道电导为14.3 pS。对这两类通道电流分别进行逆转电位分析、抑制剂鉴定、跨膜Ba2+浓度依赖性及Ca2+通透性等特性鉴定,表明实验中所记录的电流信号为跨质膜钙通透性通道的内向电流。同时发现,微丝参与了对张力激活型及电压依赖型钙通道的调控,微丝解聚后激活通道。进一步实验结果表明,渗透势对全细胞水平通道的激活作用至少部分通过张力激活型钙通透性通道来介导。利用激光共聚焦显微技术,测定渗透势、微丝解聚剂等因素对蚕豆保卫细胞原生质体胞质自由Ca2+浓度的影响,结果表明:胞外低渗、微丝解聚均可引起胞内自由Ca2+浓度的升高,且微丝解聚剂可在高渗下引起胞质Ca2+浓度升高,这些因素引起的Ca2+升高可以被胞外添加Ca2+通道抑制剂所抑制,说明胞内Ca2+浓度升高依赖于胞外Ca2+的流入。在胞内外都以Ca2+为通透离子的情况下,发现蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通道可以介导胞内K+外流,这在气孔保卫细胞对内外界刺激迅速作出反应中有重要意义。实验过程中在蚕豆保卫细胞质膜上还记录到一类高电导的钙通透性通道,单通道电导为正常通道电导的5倍,推测这类高电导通道的存在可能使某些保卫细胞对逆境信号作出更加快速的反应。本论文另一部分工作对拟南芥可能钙通道基因进行克隆及功能鉴定。克隆到的拟南芥AtTPC1基因可以互补酵母电压门控钙通道CCH1的功能并恢复Ca2+吸收缺陷型cch1的性状。利用Promoter+GUS手段对AtTPC1基因进行了幼苗到开花期植株的组织表达定位,结果显示该基因在植株整体表达,但在各组织部位的表达强度不同。利用AtTPC1-GFP策略对瞬时表达的基因产物进行亚细胞定位,基因枪转化的洋葱表皮细胞显示,GFP荧光出现在膜结构区域。利用电压钳系统对体外转录后的AtTPC1基因cRNA产物进行电压钳记录,没有记录到电流,同时转录表达的KAT1基因cRNA产物作为对照可以记录到内向电流。利用AtTPC1基因功能缺失突变体及过表达突变体进行性状筛选,所选用的指标为高盐,低钾,高、低钙,高渗透势及干旱胁迫,但未发现与野生型植株间有明显差异。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

英文缩写表

第一部分文献综述

一气孔运动及其调控

1 气孔运动：气孔的开放与关闭

2 气孔运动调控机理

2.1 质子泵对气孔运动的调控

2.2 K~+通道对气孔运动的调控

2.3 微丝骨架对气孔运动的调控

2.4 渗透势对气孔运动的调控

二植物细胞的钙及钙通道

1 植物细胞离子通道概述

2 植物细胞的钙及钙信号

3 植物细胞钙通道研究进展

三拟南芥离子通道的研究背景

四本论文工作拟解决的科学问题及意义

第二部分论文研究工作

第一章蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道的渗透调控机制

1 引言

2 材料及方法

2.1 材料培养

2.2 蚕豆保卫细胞原生质体的制备

2.3 膜片钳实验

2.4 保卫细胞胞质Ca~(2+)的测定

2.5 实验中的化学试剂

3 实验结果与分析

3.1 渗透势对蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道调控的全细胞记录、鉴定与分析

3.2 微丝骨架参与了渗透势对蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道调控过程

3.3 蚕豆保卫细胞质膜存在有张力激活型钙通透性通道

3.4 蚕豆保卫细胞质膜张力激活型钙通透性通道同样具有电压依赖性

3.5 蚕豆保卫细胞质膜张力激活型钙通透性通道电流对胞外Ba~(2+)的浓度依赖性

3.6 实验中的张力激活型通道对Ca~(2+)的通透性

3.7 利用钙通道抑制剂对蚕豆保卫细胞质膜张力激活型钙通透性通道的鉴定

3.8 微丝骨架调节剂对蚕豆保卫细胞质膜张力激活型钙通透性通道活性的调控

3.9 张力激活型钙通透性通道参与了渗透调控过程

3.10 渗透势及微丝骨架调节剂对蚕豆保卫细胞胞内自由钙浓度的调控

4 讨论与小结

第二章微丝骨架参与蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通透性通道调控的实验证据

1 引言

2 材料及方法

3 实验结果与分析

3.1 全细胞水平微丝骨架参与调控电压依赖型钙通透性通道的实验证据

3.2 单通道水平对蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通透性通道的记录

3.3 蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通透性通道电流对胞外Ba~(2+)的浓度依赖性

3.4 蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型通道对Ca~(2+)同样具有通透性

3.5 利用通道抑制剂Gd~(3+)对单通道水平电压依赖型钙通透性通道电流的鉴定

3.6 微丝骨架调节剂对蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通透性通道的调控

4 讨论与小结

第三章蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通透性通道对K~+的通透性

1 引言

2 材料与方法

3 结果及分析

3.1 蚕豆保卫细胞质膜存在有电压依赖型钙通透性通道

3.2 利用钙通道抑制剂Gd~(3+)对通道进行的鉴定

3.3 该类通道电流对胞外Ca~(2+)浓度的依赖性

3.4 胞内K~+是影响通道逆转电位偏离理论平衡电位的原因

3.5 蚕豆保卫细胞质膜上存在有高电导的双通透性通道

4 小结和讨论

第四章拟南芥TPC1基因的克隆及初步功能鉴定

1 引言

2 研究背景

2.1 环核苷酸门控类通道家族研究进展

2.2 谷氨酸受体类通道家族研究进展

2.3 拟南芥TPC1基因的研究进展

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 培养基的配制

3.3 材料培养

3.4 常用溶液及缓冲剂的配制

3.5 实验中常用实验流程

3.6 实验药品

4 结果与分析

4.1 拟南芥TPC1基因的克隆

4.2 穿梭载体pYES2-AtTPC1的构建及对酵母细胞的转化

4.3 酵母的性状检测及AtTPC1对CCH1功能互补检验

4.4 AtTPC1在拟南芥植株中的组织表达定位及亚细胞定位

4.5 拟南芥TPC1基因相关突变体的获取

4.6 拟南芥TPC1基因在植株内生理功能的寻找

5 讨论与小结

第五章爪蟾卵母细胞异源表达植物离子通道继以电压钳鉴定系统的建立

1 引言

2 材料与方法

2.1 目的基因cRNA的获取

2.2 爪蟾卵母细胞的获取

2.3 爪蟾卵细胞显微注射cRNA

2.4 爪蟾卵母细胞电压钳记录

3 实验结果及分析

第六章 CDPK参与拟南芥花粉及花粉管内向钾电流调控的实验证据

1 引言

1.1 花粉及花粉管中的Ca~(2+)及钙通道

1.2 花粉及花粉管中的K~+及钾通道

1.3 花粉及花粉管中的CDPK及作用

2 材料与方法

2.1 材料培养

2.2 花粉体外萌发

2.3 花粉及花粉管原生质体的制备

2.4 膜片钳实验

3 实验结果与分析

3.1 拟南芥花粉及花粉管原生质体内向K~+电流的测定和分析

3.2 拟南芥幼嫩、成熟花粉及花粉管全细胞内向钾通道电流差异

3.3 幼嫩、成熟花粉和花粉管原生质体内向钾电流对[Ca~(2+)]_(cyt)浓度变化反应的差异

3.4 某些CDPK参与了[Ca~(2+)]_(cyt)对花粉管内向钾通道调控的实验证据

4 小结与讨论

结论及展望

参考文献

致谢

发布时间: 2006-04-05

蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道渗透调节机制研究及拟南芥TPC1基因的克隆与鉴定

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