核糖体展示ScFv文库的构建及其在抗克伦特罗抗体筛选中的应用

论文摘要

克伦特罗（Clenbuterol,CL）是1种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂,常用作支气管扩张剂,用于支气管哮喘及肺气肿等呼吸疾病所致的支气管痉挛。当其应用剂量达到治疗量的5～10倍时,CL可增强肌肉发育,降低脂肪沉积。由于其特殊的生物学功能常被用做饲料添加剂非法用于动物的饲养。CL具有在体内吸收快,脂溶性高,残留性积累和半衰期长等药理特性,人在食用残留CL肉制品后引起的中毒事件不断发生,所以加强检测CL在肉制品中的残留非常必要。目前的理化检测方法存在仪器化程度高,检测成本高,难于推广等缺点;免疫学分析方法检测CL具有快速简便的特点,而免疫分析方法检测需要有CL的特异性抗体。基因工程重组单克隆抗体化学结构特点与单克隆抗体相同,是具有稳定的免疫特异性的1类抗体。其中,单链抗体（singe chain variable fragment,ScFv）具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点。ScFv可以通过噬菌体展示技术或核糖体展示技术加以制备。核糖体展示技术（RD）是1种完全不依赖于细胞的体外展示技术,库容量远远大于应用较成熟的噬菌体展示技术,此外RD还具有建库和筛选方法简便,没有选择压力,通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点。本文利用RD技术构建了有效容量4.24×1013的鼠源天然ScFv文库,并且从以下几个方面对文库进行了鉴定:可扩增性和多样性、转录和反转录活性、蛋白表达活性。利用重氮化法合成了CL-BSA全抗原。采用固相筛选法用制备的ScFv库筛选抗CL的抗体,并对抗体进行了特异性和灵敏度的初步分析。具体内容包括:1鼠源天然ScFv文库的构建从未经免疫的5周龄Balb/c、C57小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一链后,扩增VH、VL基因片段,大小都为350 bp左右;从载体PT7PD扩增出大小为93 bp RD元件T（包括T7启动子,5′茎环,核糖体结合位点）和大小为294 bp间隔序列P（3′茎环,间隔序列）,以重叠引物延伸法（splicing by overlapextension,SOE）将RD元件T与VH连接,P与VL连接,再将TH和LP连接成全长ScFv片段,大小约为1 100 bp,从而构建了RD鼠源天然抗体库。2鼠源天然ScFv文库质量的鉴定（1）用引物ScFv模板的上游引物T7B和下游引物PRDR扩增ScFv文库得到1 100bp的目的片断,证明文库可扩增性良好。（2）将抗体文库连接PEASY-T3载体,进行测序,测序结果显示抗体序列各不相同,不存在中止密码子和致死突变,多样性良好。（3）用Promega T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System将DNA文库进行体外转录得到500 bp的mRNA单链目的条带,将文库进行反转录得到1 100 bp的特异目的条带,证明文库具有反转录和转录活性。（4）采用TranscendTM Non-Radioactive Translation Detection Systems鉴定文库蛋白表达活性,本系统使翻译产物生物素化,抗体采用碱性磷酸酶标记链亲和素。结果显示40 kD左右处有条带,Western印迹结果显示该产物为抗CL抗体。3利用文库筛选抗CL抗体将构建的ScFv文库进行体外转录翻译后,以人工抗原CL-BSA为靶标,利用固相亲和方法筛选抗CL抗体,通过改变Mg2+浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA（ARM）三联体解离,得到相应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。通过多轮生物淘筛,ScFv高度特异富集,经过测序比对最终获得抗CL抗体序列。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达得到特异蛋白条带,经WB印迹验证该蛋白为抗CL抗体。4对CL抗体灵敏度和特异性的初步分析优化的竞争ELISA条件为:用浓度为20μg/mL的CL-BSA4℃包被过夜,抗体以pH 7.4的PBST缓冲液稀释为1:4 000,竞争抗原与抗体混匀37℃反应1 h后,加入酶标板中再反应1 h,然后加入酶标二抗（以PBST作1:1 000稀释）37℃反应1 h,加底物37℃反应20 min,用2 mol/L H2SO4终止反应,测定OD450。根据上述竞争ELISA条件,以竞争抗原CL的浓度对数为横坐标,竞争抑制率为纵坐标,作图得到CL的抑制曲线,CL的半数抑制浓度(IC50)为1 ng/mL。以肾上腺素激动剂沙丁胺醇、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、畜禽常用的抗菌药物硫酸庆大霉素和维生素A为竞争抗原分析了CL抗体的特异性,CL抗体与上述物质的交叉反应均率均小于0.07%。表现出良好的特异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 RD技术概况
• 2 RD技术的应用
• 2.1 筛选目标蛋白
• 2.2 实现蛋白质的体外进化
• 3 RD技术的前景与展望
• 4 CL检测方法的研究进展
• 4.1 HPLC法
• 4.2 CG-MS法
• 4.3 CE法
• 4.4 IA法
• 4.4.1 RIA法
• 4.4.2 EIA法
• 4.4.3 DIGFA法
• 4.4.4 BS法
• 5 研究目的和意义
• 6 技术路线
• 第二章 ScFv文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 Trizol法提取鼠脾总RNA
• 1.2.2 ScFv文库的构建
• 1.2.2.1 构建基因结构图
• 1.2.2.2 PCR过程中所用引物
• 1.2.2.3 RD元件的扩增及DNA文库全长的连接
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠脾脏总RNA的提取
• 2.2 RD元件的扩增及DNA文库全长的拼接
• 2.3 VH、VL、P以及T的连接
• 3 讨论
• 3.1 小鼠RNA提取
• 3.2 RD元件的扩增和连接
• 第三章 ScFv文库的质量鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 ScFv文库的完整性与多样性鉴定
• 1.2.1.1 DH5α感受态制备
• 1.2.1.2 ScFv文库测序
• 1.2.2 ScFv文库容量的鉴定
• 1.2.3 ScFv文库的可扩增性鉴定
• 1.2.4 ScFv文库的转录活性与反转录活性鉴定
• 1.2.5 蛋白质水平鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 ScFv文库的测序
• 2.2 ScFv抗体库容量
• 2.3 转录活性鉴定
• 2.4 反转录活性鉴定
• 2.5 蛋白质水平鉴定
• 3 讨论
• 第四章 CL全抗原的合成和抗体的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 重氮化法合成CL包被原
• 1.2.2 CL包被原的鉴定
• 1.2.3 ScFv文库的体外转录与翻译
• 1.2.4 ScFv文库的体外筛选
• 1.2.5 mRNA的纯化
• 1.2.6 RT-PCR重新构建RD模板
• 1.2.6.1 mRNA反转录
• 1.2.6.2 HLP片断的扩增
• 1.2.6.3 THLP的连接
• 1.3 抗体片段的可溶性表达
• 1.4 ELISA的交叉反应实验
• 1.5 ELISA最佳实验条件的确定
• 1.6 竞争ELISA的标准曲线
• 2 结果与分析
• 2.1 CL全抗原的合成
• 2.2 体外筛选
• 2.3 筛选后的鉴定
• 2.4 表达产物特性初步分析
• 2.4.1 SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达蛋白
• 2.4.2 ELISA测定交叉反应
• 2.4.3 方阵滴定实验
• 2.3.4 竞争ELISA的标准曲线
• 3 讨论
• 第五章 结论与讨论
• 1 结论
• 1.1 ScFv文库的构建
• 1.2 ScFv文库的鉴定
• 1.3 CL全抗原的合成
• 1.4 体外转录翻译与ScFv的筛选
• 2 讨论
• 2.1 ScFv
• 2.2 抗体库技术
• 2.3 RD模板的构建
• 2.4 体外翻译
• 2.5 体外筛选
• 参考文献
• 致谢
• 附录