交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究

论文摘要

目的:羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl chitosan,CM-CTS）是迄今为止所报道的600多种甲壳素衍生物中,研究最多的一种水溶性壳聚糖衍生物。研究证明,CM-CTS具有良好的生物相容性、生物降解性、降解可控性和抑菌性,它以其特有的理化性质已成为医药界及生物医学领域的研究热点。但CM-CTS在制备过程中要经过较长时间的浓碱高温等条件,故制成的CM-CTS的相对分子量和黏度会显著降低,作为医用高分子材料,在体内降解吸收太快,难以满足生物高分子材料的要求,因此在一定程度上限制了CM-CTS的应用范围。已有研究表明,CM-CTS具有一定的免疫调节作用。本研旨在探讨一种通过交联使CM-CTS黏度得到极大提高的的方法,并对其生物相容性及其作为免疫佐剂的应用前景进行研究。方法:实验分四部分:1、对CM-CTS的制备、纯化方法及部分理化性质进行研究,通过细胞毒性和组织相容性对CM-CTS的生物相容性进行了初步评价。2、以戊二醛作为交联剂,通过对交联剂加入量、交联体系温度、pH值以及交联反应时间等交联条件的试验,确定了所需要的交联反应体系;对CM-CTS进行适度交联,制备了具有一定交联度的交联型羧甲基壳聚糖（C-CM-CTS）和交联还原型羧甲基壳聚糖（D-CM-CTS）。3、以体外培养的小鼠成纤维细胞株L929为研究对象,对C-CM-CTS和D-CM-CTS进行细胞毒性评价,考查了二者的组织相容性。4、研究D-CM-CTS的溶血活性,通过MTT法测定了D-CM-CTS体外对Con A诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。以不同剂量的D-CM-CTS联合卵清白蛋白（OVA）免疫小鼠,观察D-CM-CTS对OVA受免小鼠细胞免疫和体液免疫应答的影响。结果:1、制备了高纯度,无菌无热原的CM-CTS,细胞毒性结果表明CM-CTS对L929成纤维细胞没有明显的毒性作用,并且对L929细胞增殖有一定的促进作用,其中以100g/mL浓度对L929细胞的促增殖作用最为显著;肌肉注射8天后观察不到炎症细胞,说明CM-CTS具有良好的生物降解性和组织相容性。2、通过戊二醛和CM-CTS的适度交联,制备了黏度提高170倍且能溶于水的C-CM-CTS和D-CM-CTS。3、细胞毒性和组织相容性试验表明D-CM-CTS比C-CM-CTS具有更好的生物安全性,该结果为D-CM-CTS在生物医用材料、药物缓释载体等的研究和应用方面提供了一定的理论基础。4、溶血性实验表明D-CM-CTS没有溶血作用,D-CM-CTS在1-1000μg/mL浓度范围内对Con A诱导的小鼠T淋巴细胞的增殖反应有显著促进作用,其中1和10μg/mL浓度促进作用极显著;不同剂量D-CM-CTS联合OVA免疫小鼠后,均能增强Con A和OVA诱导的OVA受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应和提高OVA特异性抗体的效价水平,其中以2.5%组免疫效果最好。结论:本研究制备的D-CM-CTS可将CM-CTS黏度提高170倍,无细胞毒性并能促进细胞增殖,且具有良好的生物相容性。将D-CM-CTS联合OVA免疫小鼠,证明D-CM-CTS具有良好的免疫佐剂活性。该研究结果为D-CM-CTS在生物医用材料、药物缓释载体等的研究和应用方面提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 羧甲基壳聚糖
• 1.1 羧甲基壳聚糖的制备
• 1.2 羧甲基壳聚糖的结构性能
• 1.3 羧甲基壳聚糖的应用
• 2 免疫佐剂
• 2.1 概述
• 2.2 免疫佐剂的分类
• 2.3 几类常用的佐剂及其作用机理
• 2.4 关于免疫佐剂的研究的展望
• 3 壳聚糖和羧甲基壳聚糖的免疫调节及佐剂效应
• 3.1 壳聚糖的免疫调节作用
• 3.2 壳聚糖的免疫佐剂效应
• 3.3 羧甲基壳聚糖的免疫调节作用
• 第二章 羧甲基壳聚糖的制备和性质研究
• 1 材料及仪器
• 1.1 材料及试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 羧甲基壳聚糖的制备及纯化
• 2.2 羧甲基壳聚糖羧化度的测定
• 2.3 羧甲基壳聚糖灰分测定
• 2.4 羧甲基壳聚糖的旋转黏度测定
• 2.5 羧甲基壳聚糖水份测定
• 2.6 羧甲基壳聚糖特性黏度的测定
• 2.7 羧甲基壳聚糖分子量的测定
• 2.8 羧甲基壳聚糖脱乙酰度的测定
• 2.9 羧甲基壳聚糖的红外光谱表征
• 2.10 羧甲基壳聚糖的热原检测
• 2.11 羧甲基壳聚糖生物相容性研究
• 2.12 统计学处理
• 3 实验结果
• 3.1 羧甲基壳聚糖的羧化度测定结果
• 3.2 羧甲基壳聚糖物理性质测定结果
• 3.3 羧甲基壳聚糖的红外光谱分析
• 3.4 羧甲基壳聚糖除热原后内毒素检测结果
• 3.5 羧甲基壳聚糖对L929细胞生长的影响
• 3.6 羧甲基壳聚糖的组织相容性研究
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第三章 交联型羧甲基壳聚糖的制备和性质研究
• 1 材料及方法
• 1.1 材料及试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 交联型羧甲基壳聚糖交联条件的研究
• 2.2 交联型羧甲基壳聚糖的制备
• 2.3 交联型羧甲基壳聚糖的黏度测定
• 2.4 交联型羧甲基壳聚糖的红外光谱表征
• 3 实验结果
• 3.1 交联剂的加入量对交联反应的影响
• 3.2 温度对交联反应的影响
• 3.3 pH对交联反应的影响
• 3.4 交联时间对交联反应的影响
• 3.5 CM-CTS、C-CM-CTS 和D-CM-CTS 的黏度分析
• 3.6 CM-CTS、C-CM-CTS 和D-CM-CTS 的红外图谱分析
• 4 讨论
• 4.1 戊二醛交联的CM-CTS 黏度的提高和水溶性
• 4.2 硼氢化钠还原的作用
• 5 本章小结
• 第四章 交联型羧甲基壳聚糖的生物相容性研究
• 1 材料及仪器
• 1.1 材料及试剂
• 1.2 溶液的配制
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 L929 细胞的培养
• 2.2 C-CM-CTS 和D-CM-CTS 对L929 细胞生长的影响
• 2.3 C-CM-CTS 和D-CM-CTS 的组织相容性评价
• 2.4 统计学处理
• 3 实验结果
• 3.1 C-CM-CTS和D-CM-CTS对L929细胞生长的影响
• 3.2 C-CM-CTS和D-CM-CTS的组织相容性研究
• 4 讨论
• 4.1 交联型羧甲基壳聚糖对L929细胞生长的影响
• 4.2 交联型羧甲基壳聚糖的生物相容性
• 5 本章小结
• 第五章 交联型羧甲基壳聚糖的免疫佐剂活性研究
• 1 材料及仪器
• 1.1 材料及试剂
• 1.2 溶液的配制
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 溶血性实验
• 2.2 体外小鼠脾淋巴细胞增殖试验
• 2.3 免疫程序
• 2.4 体内小鼠脾淋巴细胞增殖试验
• 2.5 血清中OVA特异性抗体效价测定
• 2.6 统计学处理
• 3 实验结果
• 3.1 溶血性结果
• 3.2 体外对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响
• 3.3 对OVA受免小鼠脾细胞增殖反应的影响
• 3.4 对OVA受免小鼠血清中特异性抗体滴度水平的影响
• 4 讨论
• 4.1 淋巴细胞的体外增殖反应
• 4.2 关于间接ELISA反应条件的选择
• 4.3 免疫小鼠血清效价的变化规律
• 5 本章小结
• 总结
• 1 主要结论
• 2 主要创新点
• 3 论文不足之处及尚需继续完成的工作
• 参考文献
• 致谢