论文摘要
近年来,稀土元素在各个领域广为应用。特别是在中国和其他一些国家,稀土微肥被成功用于促进作物生长和提高产品品质,已有30余年的历史。据报道,适量稀土对植物生长、产品品质及抗逆性方面有促进作用,但是当稀土浓度过高时,则起抑制作用,表现为“低促高抑（hormesis effect）”现象。植物体内的保护酶系统,如过氧化氢酶,过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶对稀土敏感。因此,保护酶如过氧化物酶可作为生物标记物来研究酶与稀土的相互作用。然而,由于植物细胞壁的阻隔作用,稀土能否进入细胞及其对POD在植物细胞的分布、活性和结构的影响机理,以及POD生物活性和结构的关系至今仍不清楚。辣根过氧化物酶（HRP）为POD酶超家族的一员,其主要源自辣根,且HRP分离纯化及其结构研究透彻。本论文中,HRP作为过氧化物酶的典型模型,通过多学科交叉合作,研究了轻稀土离子La3+和重稀土离子Tb3+对植物体内外的HRP活性与结构的影响。结果主要归纳如下:模拟生理溶液中,轻稀土离子La3+对HRP活性的影响随稀土浓度升高呈现“低促高抑（Hormesis effect）”现象。产生这种效应的成因是La3+改变了HRP的构象。低浓度的La3+使HRP的多肽链构象的有序结构含量增加,无序结构含量减少,使血红素卟啉环中非平面性增加,导致HRP分子血红素活性中心Fe（III）暴露程度的增加,使得HRP分子电子传递更加容易,因而HRP分子的活性增加。高浓度的La3+会使HRP分子中的多肽链构象的有序结构含量减少,无序结构含量增加,整个分子更趋近于松散,使血红素卟啉环中平面性增加,导致HRP分子血红素活性中心Fe（III）的暴露程度减弱,使HRP分子电子传递更为困难,因而HRP分子的活性被抑制。La3+可以和HRP分子中多肽的酰胺发生相互作用,改变多肽链的构象,从而对活性中心产生微扰。低浓度的La3+和HRP相互作用,只是改变了HRP的构象,其中并没有La-HRP配合物生成。高浓度的La3+和HRP相互作用,有La0.88-HRP配合物生成,0.44摩尔Ca（II）被La3+取代。HRP中Ca（II）的丢失将导致HRP活性的降低。进一步解释了HRP的活性被高浓度的La3+所抑制的现象。在La0.88-HRP配合物中,La3+和HRP多肽链酰胺的氧原子或氮原子形成共价键,使整个分子电子云密度重新分配,从而导致HRP分子生物活性的变化。辣根体内HRP的活性随La3+浓度的升高也呈现出低促高抑现象。低浓度的La3+处理辣根,稀土离子不能进入细胞内部,在细胞壁和细胞膜上有少量稀土存在,细胞超微结构完整,叶绿体类囊体的片层结构增加,能促进HRP的酶蛋白的合成和营养元素的吸收利用,如,钙,铁。低浓度La3+对辣根生长起到促进作用,此时,辣根体内没有La-HRP生成。高浓度的La3+处理辣根,稀土能进入细胞内部,细胞结构受损,HRP大多集中在细胞壁上,造成细胞衰老,对辣根植物生长起到抑制作用。在该条件下,辣根体内生成La-HRP配合物,其中La3+和HRP肽链上的氧原子或氮原子结合,La-HRP的分子量为43833 Da,pI 8.76,大约1摩尔的La3+键合到1摩尔的HRP上形成1摩尔的La-HRP。HRP和La-HRP的性质对比研究表明, La-HRP的构象和微结构不同于HRP。两者相比,La-HRP血红素基团的平面性增加,活性中心Fe（III）的电子云密度减小,从而使La-HRP的电化学和催化活性被抑制,这可能是La3+抑制辣根体内过氧化物酶的机理之一。荧光显微镜的结果表明La-HRP经食物链进入生物体,将被吸附在细胞膜上而影响膜的正常生理功能,对细胞造成伤害。在模拟生理溶液中Tb3+和HRP相互作用,主要是抑制HRP催化活性,Tb3+的这种抑制作用程度随Tb3+浓度的增加而增强。Tb3+可以和HRP分子中多肽的酰胺发生相互作用,改变了HRP多肽链的构象,从而对活性中心产生微扰。Tb3+使HRP分子中的多肽链构象的有序结构含量减少,无序结构含量增加,整个分子更趋近于松散,使血红素卟啉环中平面性增加,导致HRP分子血红素活性中心Fe（III）暴露程度的减弱,使得HRP分子电子传递更为困难,因而HRP分子的活性受抑制。MALDI-TOF/MS和XPS结果表明Tb3+对HRP活性产生抑制作用的实质是有Tb2-HRP配合物生成,其中平均每摩尔Tb2-HRP含有约2摩尔的Tb3+。在Tb2-HRP配合物中,Tb3+和HRP多肽链的氧原子形成共价键,使整个分子电子云密度重新分配,从而导致HRP分子生物活性的变化。Tb3+处理辣根,Tb3+对HRP的抑制作用是主要的,对各项生理指标都表现出伤害效应,此时Tb3+起到重金属离子的作用。电镜自显影结果显示Tb3+大多集中分布在细胞壁上,少量Tb3+能进入原生质体,并主要分布在液泡内,叶绿体内和叶绿体膜上。而此时HRP大多集中在细胞壁上,造成细胞衰老,对辣根植物生长起到抑制作用。在该条件下,辣根体内生成Tb4-HRP配合物,Tb4-HRP的分子量为44336 Da, pI 8.80,大约4摩尔的Tb3+键合到1摩尔的HRP上形成1摩尔的Tb4-HRP,同时有0.21摩尔的钙被Tb3+取代。HRP和Tb4-HRP的性质对比研究表明,Tb4-HRP的形成改变了HRP的构象和微结构,导致血红素基团的平面性增加,活性中心Fe（III）的暴露程度减小,从而使Tb4-HRP的电化学和催化活性被抑制,这可能是Tb3+抑制辣根体内过氧化物酶活性的机理之一。荧光显微镜的结果表明Tb4-HRP经食物链进入生物体,将被吸附在细胞膜上而影响膜的正常生理功能,对细胞造成伤害。在稀土农用时,我们要慎重选择稀土离子应该为轻稀土离子如镧,并控制在较低的浓度范围。重稀土离子如铽对植物生长是有害的,应避免施用。