论文摘要
卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。化疗是卵巢癌术后的重要辅助治疗手段,紫杉醇在卵巢癌化疗中占有重要地位。但卵巢癌在经过数个疗程化疗后,肿瘤细胞往往会出现获得性耐药,致使后续化疗失败。因此,如何克服卵巢癌化疗的多药耐药（multidrug resistance ,MDR）成为近年来肿瘤临床研究的热点。紫杉醇耐药的机制很多,涉及P-糖蛋白（P-glyco-protein, P-gp）表达的升高,微管β亚基的改变,微管α亚基的改变,凋亡途径改变等。P-gp是多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1,MDR1）编码的一种跨膜转运蛋白,具有ATP酶活性,能将化疗药物从细胞内泵出,降低细胞内的有效药物浓度而致多药耐药。而P-gp又由蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）磷酸化而具有活性。因此,我们培养了对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞A2780/Taxol,研究其P-gp及PKC的表达,观察使用PKC抑制剂和激动剂后P-gp表达量及功能的变化,同时应用RNAi技术沉默P-gp的表达并观察沉默后的耐药细胞内药物蓄积的浓度,为逆转耐药提供依据。目的:1.培养对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞A2780/Taxol,研究其表面P-gp及PKC-α的表达;2.观察使用PCK抑制剂SP和激动剂PMA后A2780/Taxol细胞表面P-gp表达量及功能的变化;3.应用RNAi沉默A2780/Taxol细胞MDR1基因,下调其表面P-gp的表达并观察沉默后的耐药细胞内药物蓄积的浓度,明确沉默MDR1基因后表达后能否逆转耐药。方法:1.免疫细胞化学及免疫荧光双标检测PKC-α与P-gp在耐药细胞A2780/Taxol及其亲本细胞中的表达;2.Westernblot检测并半定量分析PKC激动剂PMA和抑制剂SP作用后P-gp在两种细胞上的表达水平;3.以R123作为荧光探针,采用流式细胞仪检测PMA及SP对细胞内药物浓度的影响;4.构建RNAi MDR1真核表达载体,经脂质体转染至A2780/Taxol细胞,Westernblot检测P-gp沉默效果,MTT法绘制生长曲线,并按方法3检测细胞内药物蓄积浓度。结果:1.免疫细胞化学结果表明在A2780/Taxol中,P-gp与PKC表达均呈阳性,而在亲本细胞中,P-gp不表达,PKC呈阳性表达。免疫荧光双标结果显示在A2780/Taxol中PKC-α与P-gp有共表达。2.SP及PMA作用后,A2780/Taxol细胞中P-gp的表达量无明显差别。3.PMA作用后A2780/Taxol细胞内R123的平均荧光强度减低,SP作用后, A2780/Taxol细胞内R123的平均荧光强度明显增加。敏感细胞A2780则无此现象。4.成功构建RNAi MDR1真核表达载体,转染至A2780/Taxol细胞,G418筛选,成功获得阳性克隆株。5.MTT结果提示转染后的各组细胞生长曲线无明显差别。Westerblot结果显示A2780/Taxol细胞MDR1基因被特异沉默了,但是针对不同部位序列的shRNA真核表达载体抑制效率不同,R123外排实验结果显示转染后的A2780/Taxol/ pWH1- MDR12细胞内药物蓄积浓度明显大于A2780/Taxol细胞。结论:1.卵巢癌细胞A2780对紫杉醇耐药性产生与P-gp过表达有关;2.PKC活性的改变并不能改变A2780/Taxol细胞P-gp的表达量,但是可以通过使P-gp磷酸化增强或减弱来增高或降低其跨膜转运功能;3.RNAi技术特异性沉默A2780/Taxol细胞MDR1的表达后,细胞内药物蓄积浓度明显增高。4.采用PKC抑制剂抑制A2780/Taxol细胞P-gp的功能或利用RNAi技术降低其表面P-gp的表达可以增加细胞内药物的蓄积量,在一定程度上起到逆转耐药的作用。
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