Lactacystin诱导的PC12细胞帕金森病模型的蛋白质组学研究

论文摘要

目的:应用lactacystin建立帕金森病（PD）细胞模型,模拟人类PD的Lewy小体和细胞凋亡两种病理特征;深入研究lactacystin处理后PC12细胞的蛋白质组的变化,筛选出与PD相关的未知蛋白,为PD病因及发病机制的研究提供新的线索和依据。方法:建立lactacystin诱导的PC12细胞PD模型,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞活性及代谢状态,H&E染色观察胞浆内包涵体聚集及其演变过程,免疫组化观察α-synuclein胞内聚集,丫啶澄和溴化乙啶（AO/EB）双染及电镜检测细胞凋亡;提取10μM lactacystin作用24h细胞总蛋白,荧光染料标记和差异双向电泳分离蛋白,DeCyder软件分析差异蛋白质表达信息,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定差异蛋白质。结果:随着lactacystin浓度增大,细胞活力逐渐下降,呈浓度依赖性变化;H&E染色显示胞浆核周出现圆形或椭圆形嗜伊红的包涵体,且α-synuclein免疫组化染色阳性;随着时间延长及浓度加大,包涵体经历从无到有、逐渐增多并游走于细胞外的演变过程;10μM lactacystin作用细胞24h后AO/EB双染提示细胞早期凋亡,电镜显示细胞核变小偏位,部分胞核固缩、趋边、凝聚。提取细胞总蛋白行荧光差异双向电泳,分离出1821±47个蛋白点,DeCyder软件分析出46个蛋白点表达发生显著变化,其中26个蛋白表达上调,20个蛋白表达下调;质谱鉴定出其中6个蛋白,分别是外周蛋白（Peripherin）、酪氨酸羟化酶（TH）、热休克蛋白5（Hspa5）、丝氨酸蛋白酶抑制因子b6（Serpinb6）、醛还原酶（AS）和热休克蛋白8（Hspa8）。结论:成功地建立了lactacystin诱导的PC12细胞的PD模型,证实lactacystin对多巴胺能神经元有毒性作用,并出现胞浆内包涵体和细胞凋亡;通过先进的蛋白质组学技术发现了6个差异蛋白,其中首次在PD相关模型中发现Peripherin和Serpinb6蛋白,研究结果为PD病因及发病机制的研究提供了新的线索和依据。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词表
• 第1章 综 述
• 综述1 帕金森病模型的研究进展
• 1 在体动物模型
• 2 体外细胞模型
• 综述2 蛋白酶体抑制剂制备帕金森病模型的研究进展
• 1 蛋白酶体
• 2 泛素-蛋白酶体系统与帕金森病
• 3 常用蛋白酶体抑制剂
• 4 体内动物模型
• 5 体外细胞模型
• 6 蛋白酶体抑制剂的可能神经保护作用
• 7 帕金森病的其他模型
• 8 总结
• 综述3 蛋白质组学及其在帕金森病的研究进展
• 1 蛋白质组学的概念
• 2 蛋白质组学的发展及意义
• 3 蛋白质组学的研究内容
• 4 蛋白质组学的主要研究技术
• 5 帕金森病的蛋白质组学研究
• 第2章 Lactacystin 诱导的PC12 细胞帕金森病模型的建立
• 前言
• 材料和方法
• 1 主要药品和试剂及细胞株
• 2 主要实验仪器和设备
• 3 主要试剂的配制
• 4 实验方法
• 实验结果
• 1 lactacystin 对细胞活性的影响
• 2 H&E 染色
• 3 α-synuclein 免疫组化
• 4 AO/EB 双重染色
• 5 电镜
• 讨论
• 1. Lactacystin 作用下PC12 细胞帕金森病模型的建立
• 2. Lactacystin 诱导PC12 细胞胞浆内嗜酸性包涵体的动态变化
• 小结
• 第3章 Lactacystin 诱导的PC12 细胞帕金森病模型的蛋白质组学研究
• 前言
• 材料和方法
• 1 主要药品和试剂
• 2 主要实验仪器和设备
• 3 主要试剂的配制
• 4 分析胶荧光差异凝胶电泳（DIGE）
• 5 凝胶图像扫描
• 6 DeCyder 软件全自动分析
• 7 制备胶电泳及蛋白质鉴定
• 结果
• 1 对照组和lactacystin 处理组PC12 细胞的双向凝胶电泳图
• 2 差异蛋白点的质谱鉴定
• 讨论
• 1 外周蛋白（Peripherin）
• 2 酪氨酸羟化酶（TH）
• 3 热休克蛋白（Hspa5、Hspa8）
• 4 丝氨酸蛋白酶抑制因子b6 （Serpinb6）
• 5 醛还原酶（AR）
• 6 未鉴定出α-synuclein 蛋白的原因
• 7 总结和展望
• 小结
• 第4章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT