枯草芽孢杆菌OKB105菌株突变体文库的构建及促生相关基因的克隆和功能研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类重要的植物根围促生细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR）,能产生抗逆性强的芽孢和多种抗菌物质,还能促进植物的生长。目前,在国内外已有很多商品化的枯草芽孢杆菌生防制剂。枯草芽孢杆菌的促生和防病作用的发挥首先依赖于它们在植物根部的定殖能力,但是其定殖和促进植物生长的分子机理尚不清楚。本研究通过转座子随机诱变技术,构建了枯草芽孢杆菌突变体文库,并从中筛选促进植物生长缺陷型的突变体,克隆与枯草芽孢杆菌促生相关的基因,验证和研究这些基因的促生相关功能。目前,转座子随机诱变技术已成为发现新基因、发掘已知基因新功能的有效途径之一。Himar1转座元件,是在细菌诱变中应用最广泛的mariner家族转座元件之一,与其它转座子相比,具有转座频率高、插入位点随机性高,以及寄主范围广泛的优点。枯草芽孢杆菌OKB105菌株,对防治辣椒病毒病和烟草花叶病均有较好的效果,能显著促进植物生长,并且能诱导植物促生相关基因的表达。因此,本研究以OKB105菌株为研究对象,利用基于Himar1转座元件所构建转座子TnYLB-1,构建了包涵2000个突变体的突变体文库,并利用PCR及southern杂交的方法对随机挑选的15个突变体进行了验证。实验结果表明：pMarA质粒已被成功地转化入OKB105菌株中,并且在高温诱导下转座子TnYLB-1能够以单拷贝、随机插入到枯草芽孢杆菌OKB105基因组中。我们以基于Himar1转座诱变体系所构建的枯草芽孢杆菌OKB105突变体文库为基础实验材料,从中筛选得到7个促烟草根生长缺陷型的突变体,实验结果表明,OKB105菌株的发酵上清液能明显地促进烟草根的生长,根长增加约55.9%,而7个突变体的发酵上清液对烟草根的生长几乎没有促进效果。反向PCR对转座子插入位点的分析显示,7个促生相关基因分别与硫氧还原蛋白还原酶、丙酮酸羧化酶、跨膜糖蛋白、带有硫氰酸酶结构域的酶、7-甲基鸟苷转甲基酶、自溶酶LytC的修复蛋白和寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的编码、合成相关,影响枯草芽孢杆菌的细胞膜生物功能及糖代谢等途径。在OKB105菌株突变体文库的筛选过程中,我们得到了一个促生长缺陷型的突变体M3,其中yfnI基因被转座子TnYLB-1随机插入诱变。本研究采用构建穿梭载体pMK4-yfnI的方法使M3中yfnl基因功能得到回复,并发现该基因的功能回复转化子M3Δyfnl能显著地促进烟草根的生长,与野生型OKB105的促生效果相似,烟草主根长度都增加约65%,证明了yfnl基因与OKB105的促植物生长特性相关。通过对M3生长能力的检测发现,相同的培养条件下,M3和野生型OKB105在LB及Landy培养基中的生长情况都基本一致,证明M3的促生缺陷不是由于影响菌株生长而引起的。本研究还定量检测了M3中三个芽孢杆菌促生相关基因alsD、yhcX和ysnE相对于野生型OKB105的表达水平,Quantative RT-PCR分析结果显示,三个促生相关基因在野生型OKB105与M3中的相对表达量没有显著差异,证明yfnI基因的诱变不会引起OKB105中已知的芽孢杆菌促生相关基因表达水平的变化。因此,推测yfnI基因是通过某种未知机制来调控OKB105的促生功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇
• 第一章 转座子体内随机突变芽孢杆菌的研究进展
• 1 转座子Tn917
• 1.1 转座子Tn917的来源及发现
• 1.2 转座子Tn917的结构特征
• 1.3 转座子Tn917在革兰氏阳性菌中的应用
• 1.4 转座子Tn917的特点
• 2 转座子Tn10
• 2.1 转座子Tn10的来源及发现
• 2.2 转座子Tn10及其衍生载体的结构特征
• 2.3 转座子Tn10及其衍生载体mini-Tn10在芽孢杆菌中的应用
• 2.4 转座子Tn10及其衍生转座子mini-Tn10的特点
• 3 Mariner家族转座子
• 3.1 Mariner家族转座元件的来源及结构特点
• 3.2 Mariner家族转座元件在革兰氏阳性菌中的应用
• 3.3 Mariner家族转座元件的特点
• 第二章 植物根围促生细菌促进植物生长的机理概述及研究进展
• 1 植物根围促生细菌（PGPR）的概述
• 1.1 PGPR简述
• 1.2 PGPR在植物根围的分布
• 2 PGPR促进植物生长的表现
• 2.1 芽孢杆菌对植物生长的影响
• 2.2 假单胞菌的促生作用研究进展
• 3 PGPR促进植物生长机理的研究进展
• 3.1 PGPR的直接促生机制
• 3.2 PGPR的间接促生机制
• 下篇
• 第一章 枯草芽孢杆菌OKB105突变体文库的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基、抗生素和培养条件
• 1.3 酶、试剂和引物合成
• 1.4 枯草芽孢杆菌OKB105突变体文库的构建
• 1.5 突变体中转座子插入位点随机性及拷贝数检测
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌OKB105转化pMarA质粒
• 2.2 高温诱导TnYLB-1转座子随机插入OKB105菌株的染色体上
• 2.3 突变体中转座子插入位点随机性及拷贝数检测
• 3 讨论
• 第二章 枯草芽孢杆菌OKB105菌株促植物生长缺陷型突变体的筛选及促生相关基因的鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基、抗生素和培养条件
• 1.3 植物材料
• 1.4 酶、试剂和引物合成
• 1.5 枯草芽孢杆菌OKB105促生缺陷型突变体的筛选
• 1.6 枯草芽孢杆菌OKB105促生相关基因的鉴别
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌OKB105促生缺陷型突变体的筛选
• 2.2 枯草芽孢杆菌OKB105促生相关基因的鉴定
• 3 讨论
• 第三章 枯草芽孢杆菌OKB105促植物生长相关基因功能的验证及研究
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基、抗生素和培养条件
• 1.3 植物材料
• 1.4 酶、试剂和引物合成
• 1.5 yfnI基因促植物生长相关功能的验证
• 1.6 枯草芽孢杆菌OKB105促生缺陷型突变体M3生长能力的测定
• 1.7 Realtime-PCR定量分析突变体M3中已知的促生相关基因的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌OKB105促生缺陷型突变体M3中yfnI基因的促生相关功能的验证
• 2.2 枯草芽孢杆菌OKB105促生缺陷型突变体M3生长能力的测定
• 2.3 几种已知的促生相关基因在突变体M3中表达水平的定量检测、分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录 本研究所用的培养基配方
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文