海滩牵牛有效部位抗炎和镇痛作用及机理研究

论文摘要

潮汕地区利用当地中药预防,治疗风湿病有悠久的历史。海滩牵牛（IS）为潮汕地区生长一种中草药,长期以来,该单味中草药在临床治疗风湿病取得了良好的效果。人们用它去风祛湿,活血通络,在治疗风湿病,特别对于类风湿关节炎经常使用,有极好的疗效,表现为：消肿、镇痛、解痉。特别是长期服用后,类风湿关节炎发作期的时间缩短,症状减轻,间隔时间大大延长,未见不良反应。因此,我们对它进行系统研发。为了进一步研究有效部位的化学成分,揭示其抗炎作用和研究相关机理,采用分离手段,从有效部位中得到了其中单体成分。本试验对IS有效部位镇痛和抗炎作用进行究,为将来将其开发成为治疗风湿病的新药提供实验基础。研究目的：将此植物（IS）为本试验的乙醇提物进行化学成分预试验,筛选出有效部位,对有效部位成分做了进一步鉴定。观察IS有效部位对疼痛和炎症动物模型的镇痛和抗炎作用及其初步探讨其作用机制。研究方法：1.实验分组：大鼠随机分成五组：即对照（control）组或模型组（model）、阳性（ibu、DEX）组、EFIS高剂量（400mg/kg）组、中剂量（200mg/kg）组、和低剂量（100mg/kg）组。小鼠随机分成五组：即对照（control）组、布洛芬（ibu）组、EFIS高剂量（600mg/kg）组、中剂量（300mg/kg）组、和低剂量（150mg/kg）组。耳肿胀与角叉菜试验后取致炎耳组织与致炎右足待测。2.小鼠疼痛模型建立：小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸0.1ml/10g,制成疼痛模型。测定各组小鼠20 min内扭体反应次数。3.急性炎症模型建立：将100ul（巴豆油：乙醇：吡啶：乙醚=1：10：20：69）均匀涂在小鼠右耳正反两面致炎造成耳肿胀模型。测定各组小鼠耳肿胀度。大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶（0.1ml／只）致炎造成足肿胀模型。测定各组大鼠足跖肿胀率。4.慢性炎症模型建立：经腹部切口将两个无菌棉球（50±lmg／个,高压灭菌,各加入氨苄青霉素lmg/0.1ml/个,50℃烘箱烤干）分别植入两侧腹股沟皮下,造成慢性炎症模型。测定各组大鼠肉芽肿净重。5.佐剂关节炎模型建立：大鼠右足皮下注射Freund’s完全佐剂（Freund’s Adjuvant complete）0.1ml/只,造成佐剂关节炎模型。6.耳组织MPO的测定与足组织PGE2测定：比色法测定巴豆油诱导的耳肿胀试验中的小鼠耳组织髓过氧化物酶（MPO）的活性以及对角叉菜胶致大鼠肿胀足组织中炎症介质（PGE2）含量的影响。测定各组大鼠炎症足PGE2渗出量。7.大鼠角叉菜诱导的胸膜炎实验：连续给药7d,末次给药后1h,于大鼠右侧胸腔（尽量靠近胸腔右后角以免伤肺）注入灭菌1%角叉菜胶生理盐水溶液0.2 mL/100 g,4h后脱颈椎处死大鼠,从眼眶静脉取血,硫代巴比妥酸法测定渗出液丙二醛的含量；黄嘌呤氧化酶法测定渗出液超氧化物歧化酶的活性。在横隔周边部剖开胸腔（避免血液渗入胸腔）,然后以磷酸盐缓冲盐水液（含肝素5 U/ml-1）2ml灌洗胸膜腔,收集灌洗液准确计量,用1%冰醋酸水溶液作为稀释液,稀释至2ml,按白细胞计数法在倒置显微镜下进行观察计数白细胞。测定白细胞数、收集上清液用于测定蛋白质含量。8.小鼠急性毒性实验测定：取正常健康昆明小鼠,雌雄各半,一次性ig给药。0.75 mg/kg1.5g/kg,3g/kg,与6g/kg四个浓度（药液仅能通过灌胃针头）正丁醇提物的浓缩液,给药后自由饮水进食,雌雄各半,分别给小鼠一次性ig给药。连续观察七天,记录小鼠活动、饮食、二便、死亡等情况。结果1. EFIS对小鼠镇痛实验的影响IS连续ig给药5d后,各剂量组均减少醋酸所致的小鼠扭体反应次数,具有其镇痛作用,与对照组相比差异非常显著,（P<0.01）且高、中剂量镇痛率高于50%,表明IS对化学性刺激引起的疼痛有明显的抑制作用。2. EFIS对急性炎症模型的影响与对照组比较,阳性对照组、IS高、中、低三个剂量组动物的耳廓肿胀度存在显著性差异（P<0.01）;对于巴豆油所致小鼠耳廓肿胀的抑制率,高剂量IS为45.8%,高于阳性对照药布洛芬（32%）,中剂量IS的抑制率与阳性药相当,低剂量IS的抑制率（10.7%）低于阳性对照组,说明IS对对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用。与对照组比较,对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响IS高剂量组在致炎后1-5 h,中剂量组在致炎后2-4 h足肿胀度与模型对照组的大鼠足肿胀度相比较有明显差异,（P<0.01）可见IS可明显对抗角叉菜胶所致大鼠足肿胀程度。布洛芬也有相似作用。3. EFIS对慢性炎症模型的影响实验结果显示,阳性对照组、IS高剂量组的肉芽组织重量明显轻于空白对照组（p<0.01）,且IS大剂量组作用与地塞米松组相当,IS中剂量组与空白对照组肉芽组织重量差异显著,有显著的统计学意义（p<0.05）。说明IS对实验性肉芽组织的增生有较强抑制作用。4. EFIS对佐剂关节炎症模型的影响高剂量组能降低3,6,9,21d的足肿胀程度,中剂量也对3,6d有明显作用,布洛芬作用与高剂量相似。5. EFIS对耳组织MPO、足组织PGE2含量的影响结果表明,与空白对照组比较,阳性对照组、IS高、中、两个剂量组,动物的MPO含量存在显著性差异（P<0.001）;对于巴豆油所致小鼠耳廓MPO的抑制率,高剂量IS为63.3%与阳性药相当,阳性对照药布洛芬（66.9%）。中剂量IS的抑制率56.1%,低剂量IS的抑制率（20.1%）低于阳性对照组,说明IS对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀中MPO的含量有明显的抑制作用。据此定量测定PGE,布洛芬组和IS高、中剂量组与空白对照组比较,PGE含量（OD值）均降低,差异显著（p<0.01）,且IS高剂量组的作用与布洛芬组的作用相当;IS低剂量组的PGE含量也低于空白对照组,差别具有统计学意义（p<0.05）。6. EFIS对角叉菜诱导胸膜炎中渗出量、白细胞、蛋白含量、MDA、及SOD影响结果显示,阳性对照组、IS高剂量组的白细胞数量明显低于空白对照组,且差异极其显著（p<0.01）,可见IS能显著减少角叉菜胶所致急性炎症大鼠胸腔白细胞的数量,具有较好的抑制白细胞趋化和游走的作用。IS各剂量组均能降低角叉菜胶所致急性炎症渗出液中蛋白质蛋白含量,减少大鼠胸膜炎渗出液体积产生以及血浆中SOD与MDA生成。7. EFIS的急性毒性实验的结果结果表明,小鼠按最大容量（0.8ml/10g／次）于当日内给四个浓度的IS药液,累计剂连续观察1周,未见动物死亡,所有小鼠皮毛光泽整洁,活动、饮食正常,无稀便及尿血等异常现象。提示IS药液口服给药安全。结论IS有效部位各实验组均有不同程度的抗炎、镇痛作用,其作用机制可能是通减少PGE2、抑制MPO,减少炎症生出以及提高血浆中SOD与降低MDA生成有关。

论文目录

• 中文摘要
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• 缩略词表
• 目录
• 前言
• 1.研究背景
• 2.抗炎镇痛药物的研究现状和进展
• 3.课题的研究目的与研究内容
• 实验材料
• 1.动物
• 2.试剂与仪器
• 3.主要试剂的配制
• 实验方法
• 1. IS活性成分的提取初步分离纯化研究
• 2. 药效学实验
• 2.1. 镇痛药效实验
• 2.1.1 小鼠醋酸性扭体实验
• 2.2. 抗炎药效学验
• 2.2.1 小鼠巴豆油性耳肿胀的测定实验
• 2.2.2 大鼠角叉菜胶性足肿胀的测定实验
• 2.2.3 大鼠棉球肉芽肿实验
• 2.2.4 大鼠佐剂关节炎实验
• 2.2.5 大鼠角叉菜所致的胸膜炎实验
• 2.3. 机理研究
• 2含量的影响'>2.3.1 对大鼠炎性渗出物中PGE₂含量的影响
• 2.3.2 对小鼠炎性渗出物中MPO含量的影响
• 2.3.3 对大鼠炎性渗出物的渗出液量、白细胞及蛋白质含量的影响
• 2.3.4 对大鼠血浆中SOD、MDA含量的影响
• 4. 安全性研究
• 4.1 小鼠急性毒性实验
• 统计学处理
• 实验结果
• 1. IS活性成分的提取初步分离纯化研究
• 1.1 EFIS化学成分预试
• 2. 药效学实验
• 2.1 EFIS对醋酸所致小鼠扭体反应的影响
• 2.2 EFIS对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
• 2.3 EFIS对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响
• 2.4 EFIS对大鼠棉球肉芽肿的影响
• 2.5 EFIS对佐剂性关节炎的影响
• 3. 机理研究
• 3.1 EFIS对角叉菜胶致胸膜炎大鼠胸腔渗出液中体积,蛋白含量及WBC数的影响
• 3.2 EFIS对大鼠血浆中SOD、MDA含量的影响
• 2含量的影响'>3.3 EFIS对大鼠炎性组织中PGE₂含量的影响
• 3.4 EFIS对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀中MPO的影响
• 4. 安全性研究
• 4.1 小鼠急性毒性实验结果
• 讨论
• （一） EFIS对镇痛作用的影响
• （二） EFIS对抗炎作用的影响
• （三） EFIS安全性
• 结论
• 工作展望
• 参考文献
• 发表论文情况
• 本人简历
• 论文综述
• 致谢