白桦纤维素合成酶基因克隆与表达特征分析

论文摘要

纤维素合成酶（Cellulose synthase,CesA）以UDP-葡萄糖为底物,催化葡萄糖聚合为葡聚糖甘链,在纤维素合成中具有非常重要的作用。CesA基因以多基因家族的形式存在。本研究分别以白桦（Betula platyphylla Suk.）木质部和叶片为材料,提取总RNA,并反转录合成cDNA。设计了6对简并引物,从叶片中扩增出了两条纤维素合成酶基因片段,从木质部中扩增出了一条纤维素纤维素合成酶基因片段。利用RACE技术克隆到了它们的全长序列。Blast分析表明这三条基因与其它植物纤维素合成酶基因具有较高的同源性,为白桦纤维素合成酶基因。从叶片中克隆出的两条基因分别命名为BpCesA1和BpCesA2,从木质部克隆出的纤维素合成酶基因命名为BpCesA3。将三条CesA基因序列提交至GenBank,登录号分别为EU591529（BpCesA1）、EU591530（BpCesA2）和EU591531（BpCesA3）。通过对三条白桦CesA基因推导的氨基酸序列比对分析发现,它们具有植物纤维素合成酶基因相应的结构特征:锌指结构:8个跨膜结构域,其中两个位于N端,6个位于C端;两个易变区HVRⅠ和HVRⅡ;植物纤维素合成酶基因保守区P-CR;4个糖基结合位点。通过与拟南芥纤维素合成酶基因家族10条推导的氨基酸序列和欧洲山杨纤维素合成酶基因家族7条推导的氨基酸序列进行分别进行全序列相似性比较和进化分析,HVRⅡ区的相似性比较和进化分析,结果均表明BpCesA1与AtCesA8和PtrCesA1氨基酸序列相似性较高,在进化上比较接近;BpCesA2与AtCesA3和PtrCesA5相似性较高,在进化上比较接近;BpCesA3与AtCesA7和PtrCesA2相似性较高,在进化上比较接近。使用白桦肌动蛋白基因做为内参基因,对三条基因在不同时期的木质部、叶片和叶柄中的表达量进行RT-PCR和实时定量PCR检测。结果表明BpCesA1、BpCesA2和BpCesA3基因在木质部、叶片和叶柄中均有不同程度的表达。三条基因在第一个时期的叶柄中的表达量均最高,从在三种组织中8个时期表达量的总和看,在叶柄中三种基因均表达量最高,而BpCesA1和BpCesA3在木质部中的表达量高于在叶片中的表达量,说明BpCesA1和BpCesA3基因与次生壁的合成相关,BpCesA2基因在叶片中的表达量高于木质部,说明BpCesA2基因与初生壁的合成相关,这与拟南芥、欧洲山杨和白桦纤维素合成酶基因的进化分析结果一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 白桦概述
• 1.2 纤维素生物合成研究进展
• 1.2.1 纤维素的结构及其作用
• 1.2.2 植物纤维素合成途径研究
• 1.3 植物纤维素合成酶基因研究
• 1.3.1 植物纤维素合成酶基因研究
• 1.3.2 纤维素合成酶基因的表达规律研究
• 1.3.3 林木纤维素合成酶基因研究
• 1.3.4 参与纤维素生物合成的其它基因研究
• 1.4 研究的目的与意义
• 2 白桦纤维素合成酶基因的克隆与序列分析
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 白桦RNA的提取与RNA质量检测
• 2.2.2 用RT-PCR方法获得白桦纤维素合成酶基因片段
• 2.2.3 目的基因片段的5'RACE-PCR扩增
• 2.2.4 目的基因片段的3'RACE-PCR扩增
• 2.2.5 白桦纤维素合成酶基因序列的拼接与分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 白桦初生木质部及叶片总RNA的提取
• 2.3.2 白桦CesA基因中间片段克隆
• 2.3.3 白桦CesA基因中间片段序列分析
• 2.3.4 BpCesA1基因5'RACE和3'RACE
• 2.3.5 BpCesA2基因5'RACE和3'RACE
• 2.3.6 BpCesA3基因5'RACE和3'RACE
• 2.3.7 BpCesA1基因全长序列分析
• 2.3.8 BpCesA2基因全长序列分析
• 2.3.9 BpCesA3基因全长序列分析
• 2.3.10 三条白桦纤维素合成酶基因进化分析
• 2.4 本章小结
• 3 白桦纤维素合成酶基因表达特征分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 白桦初生木质部、叶片和叶柄总RNA的提取
• 3.2.2 cDNA的合成
• 3.2.3 引物设计
• 3.2.4 RT-PCR检测
• 3.2.5 实时定量PCR检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同时期叶片、叶柄和木质部总RNA的提取
• 3.3.2 RT-PCR检测基因的组织特异性表达
• 3.3.3 阳性克隆质粒的提取
• 3.3.4 实时定量PCR检测
• 3.4 本章小结
• 4 讨论
• 4.1 纤维素合成酶基因的克隆
• 4.1.1 RNA提取与应该注意的问题
• 4.1.2 简并引物设计与基因片段的克隆
• 4.1.3 RACE技术克隆基因全长序列
• 4.1.4 基因序列分析
• 4.2 纤维素合成酶基因组织表达特异性
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢