关键残基嫁接产生新型脱氧核酶

论文摘要

关键残基嫁接是合理设计产生新酶的一种重要途径。本研究以脱氧核酶为模型,将脱氧核酶关键残基嫁接在DNA骨架上,获得新型脱氧核酶。首先通过8-17和10-23脱氧核酶催化结构域序列比对,将它们的关键脱氧核苷酸残基植入到锤头DNA骨架（该DNA骨架源自锤头核酶相对应的DNA序列）。该重构DNA在Mn2+离子存在下具有切割RNA底物活性,称之为类锤头脱氧核酶。该脱氧核酶独特之处在于其DNA相对应的RNA序列仍保留部分锤头核酶催化活性。继之,我们又选择具有切割DNA活性的类手枪脱氧核酶做为DNA骨架,将8-17或10-23脱氧核酶关键残基嫁接到该DNA骨架非保守区域内,构建了同时具有切割DNA和RNA活性的双催化功能脱氧核酶。综上,通过关键脱氧核苷酸残基嫁接,我们获得了两类新型脱氧核酶,即类锤头脱氧核酶和双催化功能脱氧核酶。类锤头脱氧核酶构建及其独特性质证明脱氧核酶与核酶之间能够直接相互转换,为催化功能在核酸分子间传递提供证据;双催化功能脱氧核酶获得实现了“一种DNA序列,两种催化功能”目标,该DNA序列可能是脱氧核酶功能进化过程中产生的“趋异序列”（该部分研究论文投至Nucleic Acids Res.,在评审中,本人为第一作者）。上述研究结果与本课题组的“核酶编码核肽酶”研究（该部分研究论文投至PNAS,在评审中,本人为第一作者）相结合,勾勒出催化功能在生物大分子间传递基本历程,为酶的起源与进化提供了新的线索。

论文目录

• 提要
• 第一章 绪论
• 1.1 体外进化获得脱氧核酶
• 1.2 合理设计产生新功能脱氧核酶
• 1.3 脱氧核酶催化功能研究进展
• 1.4 核酶编码“核肽酶”
• 1.5 研究意义
• 参考文献
• 第二章 关键残基嫁接实现锤头核酶转换为脱氧核酶
• 2.1 前言
• 2.2 结果
• 2.2.1 类锤头脱氧核酶设计与构建
• 2.2.2 体外切割RNA 活性鉴定
• 2.2.3 类锤头脱氧核酶的突变
• 2.2.4 类锤头脱氧核酶酶学性质表征
• 2.2.5 类锤头脱氧核酶相对应RNA 活性鉴定及性质表征
• 2.2.6 酶促反应动力学分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 类锤头脱氧核酶理化性质及可能催化机理
• 2.3.2 脱氧核酶与核酶相互转换及其意义
• 2.3.3 应用与展望
• 2.4 小结
• 2.5 材料与方法
• 2.5.1 实验材料与仪器
• 2.5.2 试剂与溶液的配制
• 2.5.3 体外转录制备核酶
• 2.5.4 脱氧核酶与核酶体外活性鉴定
• 2.5.5 酶促反应动力学分析
• 参考文献
• 第三章 关键残基嫁接产生双催化功能脱氧核酶
• 3.1 前言
• 3.2 结果
• 3.2.1 双催化功能脱氧核酶设计与构建
• 3.2.2 体外活性鉴定
• 3.2.3 双催化功能脱氧核酶酶学性质表征
• 3.3 讨论
• 3.3.1 脱氧核酶的设计
• 3.3.2 双催化功能脱氧核酶与进化“趋异序列”
• 3.4 小结
• 3.5 材料与方法
• 3.5.1 实验材料与仪器
• 3.5.2 试剂与溶液的配制
• 3.5.3 双催化功能脱氧核酶体外活性鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表及待发表的论文
• 摘要
• ABSTRACT