猪生发泡期卵母细胞的玻璃化冷冻保存

论文摘要

对卵母细胞进行冷冻保存,可以使得卵源不再受到时间和空间的限制,为体外受精、核移植和转基因等胚胎工程技术的研究提供充足的原材料。猪卵母细胞中富含脂滴,对低温十分敏感,以致猪卵母细胞冷冻保存的研究进展相对较慢。开展对猪卵母细胞冷冻保存的研究为猪和其他低温敏感性物种的卵母细胞冷冻保存提供方法。玻璃化冷冻卵母细胞不需要昂贵的仪器,操作方便、快速和高效。本试验以生发泡期(germinal vesicle,GV期)的猪卵母细胞为研究对象,研究了预平衡时间、颗粒细胞和冷冻载体对卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响。为了选择最佳的猪GV期卵母细胞在玻璃化冷冻液中的平衡时间,将卵母细胞分别用10%乙二醇(ethylene glycol,EG)、20%EG平衡1min、1min(总平衡时间2min)和3min、2min(总平衡时间5min),再通过30%EG的玻璃化冷冻液处理30s,直接装入半麦管,投入液氮中冷冻保存。解冻后,体外成熟培养44h,用透明质酸酶(hyaluronidase,HE)脱除卵丘,台盼蓝染色检查存活情况,并在体视镜下观察第一极体排出情况,统计存活率和成熟率。结果发现,平衡2min和5min分别得到51.33%、45.16%的存活率,两者差异不显著(P＞0.05);体外成熟后分别得到了3.54%和10.48%成熟率,差异显著(P＜0.05);说明平衡5min的冷冻效果优于平衡2min;同时表明,冷冻保存猪GV期卵母细胞是可行的。为了研究颗粒细胞的存在对猪卵母细胞冷冻效果的影响,将包裹有3层以上或2层卵丘的猪卵母细胞在10%、20%和30%的EG分别处理3min、2min和30s后,冷冻解冻后体外成熟培养44h,统计存活率和成熟率;对照组卵母细胞不经冷冻直接体外成熟培养。结果发现,包裹有3层以上颗粒细胞的卵母细胞和包裹2层颗粒细胞的卵冷冻解冻后分别得到18.18%、42.11%的存活率,两者差异极显著(P＜0.01),均与对照组差异极显著(P＜0.01),对照组之间差异不显著(p＞0.05);体外成熟后,包裹有3层以上颗粒细胞的卵母细胞和2层颗粒细胞包裹的卵分别得到了4.55%、9.77%的成熟率,两者差异不显著(P＞0.05),但与对照组差异均极显著(P＜0.01),对照组之间差异不显著。说明脱除部分卵丘可以降低冷冻对卵母细胞造成的损伤。为研究冷冻载体对猪卵母细胞冷冻效果的,将猪卵母细胞在10%、20%和30%EG中平衡3min、2min和30s后,分别装入开口式拉长麦管(open pullstraw,OPS)管和半麦管,冷冻解冻后体外成熟培养44h,检查存活和成熟情况;对照组不经冷冻直接体外成熟。结果表明,用OPS法、半麦管法冷冻猪GV期卵母细胞存活率分别为51.47%、55.41%和成熟率分别为8.82%、10.81%,两者之间差异不显著(P＞0.05),但均与对照组存活率和成熟率94.12%、69.12%差异极显著(P＜0.01)。结果说明半麦管法和OPS法冷冻效果相同,同样适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。综合本试验的结果表明,猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存时,脱除包裹在卵母细胞外面的部分颗粒细胞,采用半麦管作为载体,在10%、20%EG平衡液中分别处理3min、2min后,再移入30%EG中处理30s,可以获得较好的发育能力。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 玻璃化冷冻保存原理
• 2 影响猪卵母细胞冷冻保存效果的因素
• 2.1 卵母细胞发育阶段
• 2.2 常用的猪卵母细胞冷冻保存方法
• 2.3 冷冻保护剂
• 3 猪卵母细胞冷冻保存效果的判定方法
• 3.1 形态学观察
• 3.2 存活情况的判断
• 3.3 冻后卵母细胞的发育潜力
• 4 问题与展望
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 预平衡时间对猪GV期卵母细胞冷冻效果的影响
• 2.2 颗粒细胞对猪GV期卵母细胞冷冻效果的影响
• 2.3 冷冻载体对猪GV期卵母细胞冷冻效果的影响
• 3 讨论
• 3.1 预平衡时间对冷冻保存效果的影响
• 3.2 卵丘细胞存在对冷冻保存效果的影响
• 3.3 冷冻载体对冷冻保存效果的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
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