论文摘要
目的大肠癌是一种常见的消化系统肿瘤,目前的基础性研究主要集中在对它的发病机理的研究方面,临床研究主要集中在对大肠癌早期诊断与治疗的研究,随着对疾病认识的进展,研究者逐步认识到,不论从基础、临床还是预防方面都需要对大肠癌细胞的生物学性状有一个深刻的了解。细胞株的建立为研究细胞的生物学特性提供了一个较好的靶材料。本实验拟建立人大肠癌细胞株,为大肠癌的致病机制研究、提供一个良好的细胞模型。方法本实验分为四部分:第一部分为肿瘤组织的体外培养,患者男性,年龄70,取手术切除的该患者的新鲜大肠癌组织,病理确诊为直肠管状腺癌Ⅱ级,采用组织块培养法与Ⅳ胶原酶消化法做细胞原代培养。在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养扩增,稳定传代,倒置显微镜下观察细胞形态特征和细胞生长的状况。第二部分对所培养的细胞进行鉴定,包括:(1)HE染色观察固定细胞的形态,看是否具有肿瘤细胞的形态学特点。(2)透射电镜下(TEM)观察细胞的超微结构,从细胞内部观察是否符合癌组织的特点。(3)免疫细胞化学鉴定细胞角蛋白来判断细胞的组织来源,是否符合癌起源于上皮组织的特性。第三部分对所培养细胞进行生物学性状的描述。采用MTT法绘制细胞的生长曲线;流式细胞技术检测细胞DNA指数,分析研究细胞的染色体倍性;并采用boyden小室观察细胞的转移力。第四部分为动物实验,BALB/C nunu裸鼠腋背部皮下接种3×10~6(200u1),4周后处死裸鼠,取出瘤组织做病理诊断,做HE染色观察,观察是否仍具有肿瘤的特点,观察细胞的成瘤性。结果(1)大肠癌细胞在体外连续培养4个月,体外培养初步成功。(2)细胞生长曲线表明,在原代培养时细胞生长较慢,传代后细胞生长速度加快,细胞每传一代时间为1W。(3)倒置显微镜下观察细胞呈梭形及不规则多角形,有聚集生长趋势;HE染色显示核大蓝染,符合癌细胞的形态学特征;细胞角蛋白鉴定胞浆黄染,CK阳性,证明癌细胞起源于上皮组织;透射电镜下,见细胞核大、细胞内丰富的线粒体、表面微绒毛,细胞间连接复合体结构,符合代谢旺盛的癌细胞的特点。流式细胞DNA倍体分析结果证明细胞为异倍体细胞,也证明了肿瘤细胞的特点;boyden小室实验表明此细胞具有转移性。(4)动物实验,BALB/C nunu裸小鼠腋背部皮下接种三天后,可见接种部位产生小米粒大小肿物,1W后肿物增大,随着瘤组织的继续增大,4W后裸小鼠精神不佳,体表温度降低,此时测量瘤组织最终大小为2×2.5cm,瘤组织HE染色结果显示细胞排列紊乱、失去了正常细胞所具有的接触抑制的性质,具有癌细胞的形态学特征。结论本实验在体外成功进行了人大肠癌组织来源的癌细胞的原代培养、稳定传代,并对其生物学性状进行了初步描述及鉴定,初步证明了此细胞来源于上皮组织,具有癌细胞的主要形态特征,此细胞具有转移性和成瘤性的特点,为人大肠癌细胞的成功建株奠定了基础。