大白菜和萝卜败蕾相关基因的差异表达及克隆研究

论文摘要

大白菜和萝卜败蕾是育种实践中普遍存在的一种不利的生物现象,阐明其分子生物学机理具有重要的理论意义和实践价值。本研究采用mRNA差异显示技术研究了萝卜败蕾与正常花蕾基因的表达差异,结合电子克隆技术进行了cDNA全长克隆;采用cDNA-AFLP技术研究了大白菜败蕾连续取样材料的基因表达差异。取得的主要研究结果如下:1.以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为材料,比较了酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法与BIOZOL试剂法提取RNA的效果,并对DDRT-PCR体系中Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物及cDNA的用量进行了优化,获得了适合于萝卜的RNA提取方法和最佳DDRT-PCR体系。2.提取了萝卜雄性不育系败蕾和正常花蕾的RNA,用3条锚定引物T14A、T14G、T14C和26条随机引物B0301-B0326组成的78个引物组合对萝卜败蕾材料进行了DDRT-PCR分析,得到了如下结果:（1）获得了107个差异表达片段,其中13个为败蕾表达量下降的片段,94个为败蕾表达量上升的片段;（2）回收、克隆、测序获得有效EST序列89个。采用NCBI的BLAST序列检索表明,BLASTx分值大于80的ESTs 16条,其中7条为与能量代谢相关,5条为与新陈代谢相关蛋白,1条与人类蛋白相关,3条功能未知;BLASTn分析表明,有15条为无同源性的ESTs,是新发现的萝卜表达序列片段,已将它们登录到GenBank,分别是: EST36-1:登录号FG124881 dbESTId:56786563; EST28-3:登录号FG124882 dbESTId:56786564; EST39-1:登录号FG124883 dbESTId:56786565; EST59-1:登录号FG124884 dbESTId:56786566; EST61-1:登录号FG124885 dbESTId:56786567; EST45-2:登录号FG124886 dbESTId:56786568; EST23-1:登录号FG124887 dbESTId:56786569; EST71-1:登录号FG124888 dbESTId:56786570; EST64-1:登录号FG124889 dbESTId:56786571; EST100-1:登录号FG124890 dbESTId:56786572; EST56-1:登录号FG124891 dbESTId:56786573; EST87-1:登录号FG124892 dbESTId:56786574; EST38-2:登录号FG124893 dbESTId:56786575;EST17-1:登录号FG124894 dbESTId:56786576; EST97-1:登录号FG124895 dbESTId:56786577; 3.BLASTx检索发现,7个与能量相关的蛋白同源序列全部来自叶绿体;4个与新陈代谢相关的蛋白同源序列中,3个为叶绿体成熟酶K,一个是甲基转移酶。其中叶绿体Mat K在不同的引物组合中3次扩增出现。4.BLASTn检索发现,萝卜败蕾中28个差异表达ESTs与已知功能的ESTs有同源性,其中与植物逆境胁迫、衰老相关的分别为11条和7条。同时发现败蕾DNA表现有规则的Ladder,而正常花蕾只有单一DNA带。说明萝卜败蕾可能存在着与植物抵抗逆境胁迫和衰老相似的细胞程序化死亡机制。5.获得了萝卜RNA解螺旋酶基因和光系统I的Ycf4蛋白部分基因。对EST14-2和EST35-1电子克隆后,RT-PCR获得了大小分别为941bp和976bp的cDNA,分别编码307个氨基酸和141个氨基酸,氨基酸序列同源性分析表明,cDNA片段EST14-2与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的RNA解螺旋酶高度同源,同源性达到96%;cDNA片段EST35-1与陆地棉（Gossypium hirsutum）、葶苈（Draba nemorosa）、香雪球（Lobularia maritima）、毛南芥（Arabis hirsuta）等植物光系统I的ycf4蛋白高度同源,同源性分别为89%、96%、97%和95%。6.采用A4-A19和T4-T19组合的256对引物对大白菜败蕾基因表达进行cDNA-AFLP分析,共得到192个差异表达片段,大小分布在100-1 000bp之间,根据“败蕾→正常花蕾”表达情况可以分为:“强→弱”56条（占29.2%）、“弱→强”33条（占17.2%）、“有→无”52条（占27.1%）和“无→有”51条（占26.5%）4种类型。选取88个差异明显的片段回收、克隆、测序和同源性比较分析。得到72条ESTs,其中62条ESTs Blastx比对分值大于80,将它们分为7类:（1）能量和新陈代谢相关的ESTs 30条,约占48.4%,（2）膜和运输相关的ESTs 9条,约占14.5%,（3）转录和翻译相关的ESTs 15条,约占24.2%,（4）氨基酸合成和加工相关的ESTs 3条,约占4.8%,（5）信号传导相关的EST 1条,约占1.65%,（6）防御相关的EST 1条,约占1.65%,（7）分类不确定的ESTs 3条,约占4.8%。7.对大白菜败蕾的EST54-1进行了电子克隆,并通过RT-PCR验证,获得了1个大白菜新基因—大白菜苹果酸脱氢酶基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物细胞程序化死亡
• 1.1.1 植物细胞程序化死亡研究进展
• 1.1.2 高等植物营养器官发育中的PCD
• 1.1.3 生殖器官发育中的PCD
• 1.1.4 植物PCD 与植物的防御反应
• 1.1.5 植物PCD 相关的基因
• 1.1.6 用于植物PCD 的研究方法
• 1.1.7 植物PCD 与育种的关系
• 1.1.8 大白菜及萝卜败蕾现象
• 1.2 cDNA-AFLP 技术
• 1.2.1 cDNA-AFLP 技术的原理
• 1.2.2 cDNA-AFLP 的技术流程
• 1.2.3 cDNA-AFLP 技术的特点
• 1.2.4 cDNA-AFLP 技术的应用
• 1.3 mRNA 差异显示技术
• 1.3.1 mRNA 差异显示技术的原理
• 1.3.2 mRNA 差异显示的特点
• 1.3.3 mRNA 差异显示技术的改进
• 1.3.4 mRNA 差异显示技术的应用
• 1.4 电子克隆技术
• 1.4.1 电子克隆的原理
• 1.4.2 电子克隆的方案
• 1.4.3 电子克隆的应用
• 1.5 本研究目的与意义、研究内容与技术路线
• 1.5.1 本研究目的与意义
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 本研究的技术路线
• 第二章 m RNA 差异显示技术分离萝卜败蕾基因
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 生化试剂及引物序列
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 DNA 提取质量
• 2.2.2 两种RNA 提取方法的比较
• 2.2.3 DDRT-PCR 扩增体系优化
• 2.2.4 RNA 提取质量
• 2.2.5 萝卜败蕾 DD-PCR 扩增
• 2.2.6 cDNA 片段的克隆及菌液PCR 的鉴定
• 2.2.7 测序所得EST 序列分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 萝卜败蕾材料DNA Ladder 的研究
• 2.3.2 mRNA 差异显示技术的优、缺点及克服假阳性的方法
• 2.3.3 败蕾的可能机理
• 第三章 萝卜相关的ESTs 的电子克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料、种子序列和引物
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 RT-PCR 验证
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 电子克隆
• 3.2.2 RT-PCR 验证
• 3.2.3 EST14-2 序列分析
• 3.2.4 EST35-1 电子克隆序列分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 RNA 解螺旋酶与萝卜败蕾的可能关系
• 3.3.2 光系统I 组装蛋白ycf4 与萝卜败蕾的可能关系
• 3.3.3 电子克隆的优缺点
• 3.3.4 本研究的意义
• 第四章 大白菜败蕾相关基因的cDNA-AFLP 差异表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 大白菜不同败蕾时期花蕾RNA 提取与纯化
• 4.2.2 cDNA 一链合成
• 4.2.3 cDNA 二链合成
• 4.2.4 预扩增
• 4.2.5 选择性扩增
• 4.2.6 大白菜败蕾相关基因差异片段的序列分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 大白菜败蕾与萝卜败蕾的异同点
• 4.3.2 大白菜败蕾的可能机理
• 4.3.3 cDNA-AFLP 技术的优、缺点
• 4.3.4 完整开放阅读框的判断原则
• 第五章 大白菜败蕾相关EST 的电子克隆及序列分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试材料、种子序列和引物
• 5.1.2 方法
• 5.1.3 RT-PCR 验证
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 电子克隆
• 5.2.2 RT-PCR 验证
• 5.2.3 EST54-1 序列分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 叶绿体苹果酸脱氢酶
• 5.3.2 大白菜电子克隆的可行性分析
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介