论文摘要
舒胸片系《中国药典》2005版一部收载的复方中药制剂,由三七、川芎、红花三味中药制备而成。三七含皂苷类成分（人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1）,川芎含生物碱类成分（川芎嗪）与有机酸类成分（阿魏酸）,红花含黄酮类成分（羟基红花黄色素A）。本文对舒胸片混合提取液中上述6种有效成分在大孔树脂上的吸附与脱吸附性能及其动力学进行了系统的研究。1.目的探索复方中药（舒胸片）中不同结构类型的有效成分在大孔树脂上的吸附与脱吸附规律,为寻找一种适于中药复方多组分分离纯化的方法提供实验依据。’2.方法（1）舒胸片混合提取液中6种有效成分的含测方法研究：采用HPLC法,人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,检测波长203nm;川芎嗪以甲醇-水（50：50）为流动相,检测波长280nm；阿魏酸以甲醇-1%的醋酸（35：65）为流动相,检测波长320nm；羟基红花黄色素A以甲醇-1%磷酸水溶液（38：62）为流动相,检测波长403nm；并分别进行方法学考察。（2）舒胸片混合提取液制备方法的研究：选择乙醇浓度、浸泡时间、加醇量、提取时间作为考察因素,以浸膏得率及三七总皂苷的浸出量为评价指标,采用均匀设计优选三七醇提工艺条件；以浸膏得率和川芎嗪、阿魏酸、羟基红花黄色素A的浸出量为指标,考察不同加水量对川芎、红花浸出的影响；以川芎嗪、阿魏酸、羟基红花黄色素A含量为指标,考察川芎、红花水提液用醇沉法预处理的可行性。（3）静态吸附-脱吸附性能及其动力学的研究：①以比吸附量（A）与相对比吸附量（RA）为指标,考察舒胸片混合提取液中上述6种有效成分在LSA-7、LSA-10、A-30、D101A、D-100五种大孔树脂上的吸附性能。②以脱吸附量与洗脱率为指标,分别用50%、70%乙醇为洗脱剂,考察上述6种有效成分在LSA-7、LSA-10、A-30、D101A、D-100五种大孔树脂上的脱吸附性能。③以比吸附量（A）为指标,在pH4.0-6.0,考察pH对上述6种有效成分在LSA-7、A-30、D101A、D-100四种大孔树脂上吸附性能的影响。④以比吸附量（A）为指标,考察药液浓度对上述6种有效成分在A-30、D-100二种树脂上吸附性能的影响。⑤以比吸附量（A）与相对比吸附量（RA）为指标,考察单味红花提取液中羟基红花黄色素A在A-30、D-100二种树脂上的吸附性能,并与混合提取液进行比较。⑥通过测定不同时间的吸附量（Ai）,考察上述6种有效成分在A-30、D-100二种树脂上的静态吸附动力学特性。（4）动态吸附-脱吸附性能及其动力学的研究：①以比吸附量（A）为指标,在动态吸附条件（pH5.0,流速2BV·h-1）下,考察上柱药液浓度对6种有效成分在A-30、D-100二种树脂上的吸附性能的影响。②以比吸附量（A）为指标,在动态吸附条件（流速2BV·h-1）下,考察上柱药液pH值对6种有效成分在A-30、D-100二种树脂上的吸附性能的影响。③以洗脱量与洗脱率为指标,考察用不浓度乙醇梯度洗脱,6种有效成分在A-30与D-100二种树脂柱上的脱吸附情况。④以比吸附量（A）为指标,考察单味红花、川芎、三七提取液中各有效成分在A-30树脂柱上的吸附情况,并与复方提取液进行比较。⑤通过在一定的吸附条件下（pH5.0,流速2BV·h-1）使药液通过A-30树脂柱,并测定每一份泄漏液中6种成分的浓度或泄漏率,考察各成分的吸附动力学特性。⑥以70%乙醇为洗脱剂,通过测定每一份洗脱液中6种成分的浓度或洗脱率,考察各成分的脱吸附动力学特性。（5）多级吸附分离法纯化舒胸片混合提取液的初步研究：①针对羟基红花黄色素A在第一级树脂（A-30,pH=5）柱中很少被吸附,以比吸附量（A）和洗脱率为指标,考察pH2时A-30、D101A、D-100三种树脂对羟基红花黄色素A的吸附与脱吸附性能。②通过在一定的吸附条件下（pH2.0,流速2BV·h-1）使第一级吸附后的泄漏液通过第二级树脂（D-100）柱,并测定第二级附后的每一份泄漏液中羟基红花黄色素A的浓度或泄漏率,考察羟基红花黄色素A在第二级柱的吸附动力学特性。③以70%乙醇为洗脱剂,通过测定每一份洗脱液中羟基红花黄色素A的浓度或洗脱率,考察羟基红花黄色素A在第二级柱的脱吸附动力学特性。④以纯化前后干膏得率及干膏中6种有效成分的含量为指标,考察多级吸附分离法纯化舒胸片混合提取液的效果。3.结果（1）对舒胸片混合提取液中6种有效成分的含测方法研究表明：在选定的色谱条件下采用HPLC法测定,舒胸片混合提取液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、川芎嗪、阿魏酸、及羟基红花黄色素A均可与其它色谱峰达到良好的分离,其分离度Rs均大于1.5,阴性对照未见干扰,平均回收率为98%-102%,RSD均在2.5%以内。（2）对舒胸片混合提取液的制备方法研究表明：三七细粉,以50%乙醇为溶剂,浸泡2.5小时,回流提取2次,加醇量分别为药材的8倍、6倍量,提取时间分别为2.5小时、2.0小时,三七总皂苷的转移率可达95%以上；川芎、红花煎提时,三次加水量以10、8、8倍量为佳；川芎、红花煎提液采用醇沉法预处理,其药液浓度为1g生药·mL-1,药液含醇量为70%时,川芎嗪、阿魏酸、羟基红花黄色素A保留率高（达90%以上）,且可减少对大孔树脂的污染。（3）静态吸附-脱吸附性能及其动力学的研究表明：①6种有效成分在LSA-7、LSA-10、A-30、D101A、D-100五种大孔树脂上的吸附性能依次为：人参皂苷Rb1>三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、川芎嗪、阿魏酸>羟基红花黄色素A,其中羟基红花黄色素A的吸附能力很弱,难以用上述五种树脂从复方提取液中将其富集纯化。另外,对6种有效成分,五种树脂所表现的综合吸附性能未见明显差异（P>0.05）。②对6种有效成分,五种树脂中以A-30、D-100二种树脂的脱吸附性能相对为佳。另外,相对于50%乙醇,用70%乙醇为洗脱剂可适当提高各成分在树脂上的洗脱率。③对同一树脂,6种成分中以阿魏酸、羟基红花黄素A受pH影响较大,pH越低,比吸附量越大；对同一成分,树脂不同,pH影响的趋势亦有差异,其中极性树脂LSA-7与三种非极性树脂有明显的不同。④当浓度低时,6种成分的比吸附量随浓度升高一般均呈增加的趋势；浓度较高时,比吸附量随浓度升高增加不明显,有的反而呈下降趋势。另外,6种有效成分的吸附等温线均可用Langmuir方程或Freundlich方程二种模型较好地拟合（P<0.05或P<0.01）。⑤红花提取液中羟基红花黄色素A在A-30、D-100二种树脂上的比吸附量与相对比吸附量（RA）均高于混合提取液,表明混合提取液中各成分之间可能存在竞争性吸附。⑥A-30树脂对混合提取液6种有效成分的静态吸附动力学曲线,在起始阶段（10-30mmin）即已达到较大的比吸附量,此后直至24h,比吸附量总体呈缓慢增加趋势,表明其吸附过程可能为单一的吸附机理。D-100树脂对6种有效成分的静态吸附动力学曲线中,除羟基红花黄色素A外,其它5种成分均有一较明显的“平台区”,表明其吸附过程可能包含二种吸附机理。（4）动态吸附-脱吸附性能及其动力学的研究表明：①上柱药液生药浓度为0.3-0.6g·mL-1范围内,6种有效成分在A-30树脂上的动态比吸附量一般均大于D-100树脂。其中生药浓度为0.4g·mL-1时,各成分在A-30树脂上均有较佳的比吸附量。②不同成分在同一树脂上的比吸附量随pH变化趋势视树脂种类不同差异有大有小。对于A-30树脂,除阿魏酸外,其它5种成分比吸附量随pH变化趋势较为相似,且均以pH5时为最佳,阿魏酸在此pH亦可获得较佳的比吸附量；而对于D-100树脂,6种成分的比吸附量随pH变化趋势差异较大,但pH4时各成分均可获得较佳的比吸附量。结构类型相同的成分,pH对其在树脂上的吸附性能影响不一定相同,如三七所含三种皂苷在A-30、D-100二种树脂上的比吸附量随pH的变化趋势亦有程度不等的差异。对于有机弱酸类（如阿魏酸）、黄酮类（如羟基红花黄色素A）,pH增加,可明显降低其在非极性树脂上的吸附性能；对生物碱类成分,如川芎嗪,pH增加,其在非极性树脂上的吸附性能稍有增加。③对同一树脂,6种不同结构类型的有效成分在梯度洗脱过程中脱吸附的难易（或快慢）虽然不完全相同,但均可用70%乙醇将其基本洗脱下来。对不同树脂,6种有效成分在梯度洗脱过程中脱吸附快慢存在明显的差异,D-100树脂明显快于A-30树脂,用50%乙醇即可将上述各成分基本脱吸附完全（人参皂苷Rb1除外）。但从10%乙醇到95%乙醇各成分的累积洗脱率来看,A-30树脂优于D-100树脂。④单味红花、川芎、三七提取液中的有效成分在A-30树脂上的比吸附量,除人参皂苷Rbl外,其余均大于混合提取液在A-30树脂上相应成分的比吸附量,进一步说明混合提取液中各成分之间可能存在竞争性吸附。⑤6种成分成从A-30树脂柱出现明显泄漏的顺序依次是：羟基红花黄色素A→三种皂苷→阿魏酸→川芎嗪,其中羟基红花黄色素A泄漏很快,三种皂苷出现明显泄漏的时间十分相近,阿魏酸的泄漏为一缓慢增加过程,川芎嗪几乎在其它5种成分均100%泄漏时才开始。另外,6种成分的泄漏曲线（开始阶段）均可用一级（或零级）速度方程较好拟合（P<0.01）,据此方程可计算出各成分的泄漏曲线参数（包括速率常数、泄漏终点V终、AUC终、泄漏总量、树脂吸附总量）。⑥6种有效成分的洗脱曲线形状十分相似,除羟基红花黄色素A达到峰浓度的时间有些提前外,其它5种成分的达峰时间（tnax）均相同,且6种有效成分用70%乙醇洗脱至7倍柱体积时均可基本洗脱完全。另外,6种成分的洗脱曲线（末端部分）均可用一级速度方程较好拟合（P<0.01）,据此方程可计算出各成分的末端洗脱曲线参数（包括速率常数、AUC（?）、洗脱总量、洗脱终点）。（5）多级吸附分离法纯化舒胸片混合提取液的初步研究表明：①单味红花提取液在pH2时,三种树脂（A-30、D101A、D-100）对其所含羟基红花黄色素A的比吸附量以A-30最高,其次是D-100,与pH4时相比,这二种树脂对羟基红花黄色素A的比吸附量均有明显升高。而脱吸附性能方面,D101A、D-100二种树脂相近,均优于A-30树脂。综合吸附与脱吸附情况,认为以D-100树脂用于第二级吸附为佳。②羟基红花黄色素A在第二级吸附的动力学曲线（泄漏曲线）,其开始阶段可用一级速度方程较好拟合（P<0.01）,并据此计算出羟基红花黄色素A在第二级吸附的泄漏终点为5.8BV。③羟基红花黄色素A在第二级柱的脱吸附动力学曲线（洗脱曲线）,其末端部分也可用一级速度方程较好拟合（P<0.01）,并据此计算出羟基红花黄色素A在第二级柱的洗脱终点为3.9BV。④采用二级吸附分离法纯化舒胸片混合提取液,与未纯化的干浸膏相比,纯化后的干膏得率降低达5.5倍,6种有效成分在干膏中的含量（或纯度）提高约3-5倍,有效成分的转移率为58%-87%。4.结论（1）采用HPLC法测定舒胸片混合提取液6种有效成分,方法可靠、准确、专属性强,可作为各成分在大孔树脂上吸附-脱附性能及其动力学特性研究中的含量测定方法。（2）醇提、水提、及醇沉法预处理水提液的考察结果,可为合理确定舒胸片混合提取液的制备工艺提供实验依据。（3）静态吸附-脱吸附性能及其动力学的研究结果,可为快速筛选适合于复方多组方分离纯化的大孔树脂种类提供一种简便方法。另外,静态吸附动力学特性的考察,对于了解复方多组分在树脂上的吸附机理可能有一定的启示。（4）动态吸附-脱吸附性能及其动力学的研究结果,可为确定复方提取液最佳的上柱工艺条件（包括药液浓度、pH、比上柱量、吸附或泄漏终点等）与洗脱工艺条件（包括洗脱剂种类、洗脱终点等）提供实验依据。另外,复方多组分在大孔树脂上的动态吸附动力学研究结果,对于复方多组分的分离纯化具有非常大的指导意义,它可直观地判断复方多组分是否可以在单一吸附条件下同时分离纯化,并可为设计“多级吸附分离法”纯化中药复方多组分提供科学依据。（5）“大孔树脂多级吸附分离法”用于复方多组分的分离纯化具有一定的可行性。它是一种可将多种树脂或多种吸附工艺条件组合应用的新方法,能使吸附性能差异较大的多种成分在分级（或分步）吸附与脱吸附中达到分离纯化,从而避免单一吸附工艺条件下复方中某些有成分的泄漏损失。该法将进一步丰富大孔树脂吸附分离法的内涵,并有望为解决中药复方分离纯化这一关键问题打开突破口或提供一种新的思路与方法,但尚有待大量研究予以验证。
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